动物生物安全三级实验室硬件运行与维护初探

动物生物安全三级实验室(ABSL-3)是目前我国生物防护级别最高实验室。其建设规范要求高,对硬件系统要求极其严格,与之对应的安全文件体系也较为严格和复杂,管理人员不仅需要有微生物学的相关知识,还需要有自动控制、电力管理等多学科的交叉背景。如何为实验人员提供安全、稳定、舒适的实验环境不仅是实验室硬件运行与管理需要探讨的重要内容,同时也是确保安全实验的前提。

虚拟现实技术在医学实验教学课程中的应用

随着基础医学教学改革的不断深入以及计算机网络技术的不断普及,网络化教学的地位日益重要;其中,利用虚拟现实技术构建的虚拟实验室在医学实验教学课程中起着其他技术手段无法替代的作用,可以促进实验教学课程的教学改革与发展。

埃博拉病毒感染的实验室检测方法

2014年初,西非埃博拉病毒感染暴发,且流行呈播散趋势,引起全球高度重视。由埃博拉病毒引起的埃博拉病毒病具有潜伏时间短、发病急、传染性强和致死率高的特点,目前尚无预防疫苗和特异治疗药物。早诊断并隔离治疗可降低病毒的传播风险,这对准确、快速和敏感的实验室检测方法的需求增加。现将有关埃博拉病毒感染实验室检测方法作简要综述。

献血者HCV RNA实时荧光定量PCR方法的建立

目的建立快速检测献血者中丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染的方法。方法利用体外转录制备的HCV RNA转录体进行病毒RNA抽提方法及抽提效率的比较;将RNA转录体与正常血清进行不同数目的混合,对最佳混合标本数进行了摸索;建立HCV荧光定量PCR方法(fluorescence quantitative PCR,FQ-PCR),并对献血者进行混合标本HCV核酸检测。结果确定了比较理想的病毒RNA抽提方法;用于HCV核酸检测的混合标本数为24例;建立的荧光定量PCR方法能最低检测出10个copies/ml;采取24例混合血标本方法,FQ-PCR检测HCV RNA,576例ELISA检测HCV阴性的献血者未检测出HCV RNA。结论初步建立了献血者HCV感染的混合标本荧光定量PCR检测方法。

基孔肯雅病毒包膜蛋白E2的全基因合成及原核表达

目的通过对全长基孔肯雅病毒包膜蛋白E2(CHIKV-E2,1～404 aa)及其跨膜疏水区(351～378 aa)缺失突变体E2(1～350 aa)进行原核表达,分析跨膜疏水区对E2蛋白在大肠杆菌中表达的影响。方法利用ExPasy预测软件对E2蛋白跨膜疏水区进行预测分析,根据GenBank数据库中CHIKV-E2氨基酸序列获得其对应的基因序列。结合重叠延伸PCR(OE-PCR)原理设计用于全基因合成的核酸引物对CHIKV-E2全长基因(404 aa)进行体外合成,构建全长E2蛋白及其缺失突变体原核表达质粒,将序列正确的两种重组质粒分别转至E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测重组质粒的表达情况。结果 OE-PCR法成功合成了大小为1 212 bp的编码CHIKV-E2(1～404 aa)蛋白的全长基因,构建了全长E2蛋白及其缺失突变体重组表达质粒pET21b-E2(1～404)和pET21b-E2(1～350),经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE结果显示缺失突变体pET21b-E2(1～350)融合蛋白表达量较pET21b-E2(1～404)有明显提高。结论 E2蛋白跨膜疏水区(351～378 aa)对该蛋白的原核表达具有重要影响,缺失该疏水区的突变体在大肠杆菌中表达量比全长E2蛋白表达量明显提高。

16S rDNA扩增及测序在细菌鉴定与分类中的应用

16SrDNA扩增及测序技术在细菌的鉴定与分类研究中发挥着越来越重要的作用。本文就16SrDNA结构、可变区和保守区部分序列或全序列在临床上细菌鉴定和新细菌识别等方面的研究进展进行综述,并对其在临床实验室中的应用进行展望。

人IgMμ链恒定区各肽段的基因合成原核表达及免疫原性分析

目的全基因合成并原核表达免疫球蛋白M的重链(IgMμ链)及其各肽段,与天然的IgM、IgMμ链和IgG进行免疫原性的分析比较,进一步了解IgMμ链恒定区的结构与功能。方法根据GenBank数据库IgMμ链恒定区(CH1-CH4)的cDNA序列并进行必要的大肠杆菌密码子优化,利用重叠延伸PCR(OE-PCR)体外基因合成人IgMμ链恒定区全长(CH1-CH4)及其截断片段CH1-CH2和CH3-CH4。原核表达并纯化相应的3种融合蛋白PET32a-rMμCH1-CH4、PET32a-rMμCH1-CH2和PET32a-rMμCH3-CH4,并分别免疫BALB/c小鼠。同时设天然人IgM、IgMμ链和IgG免疫组为对照。再用ELISA法检测6种血清,分析比较其抗原性及免疫原性。结果利用OE-PCR方法体外成功合成1 359 bp的IgMμ链(CH1-CH4)全长基因、651 bp的IgMμ链CH1CH2和708 bp的IgMμ链CH3CH4,并构建相应原核表达质粒PET32a-rMμ1-4、PET32a-rMμ1-2和PET32a-rMμ3-4,血清ELISA检测结果显示:①IgG免疫原性>IgM>IgMμ链>rMμ1-4>rMμ1-2>rMμ3-4;②IgM免疫的血清与IgG有较强的交叉反应性,IgG免疫的血清与IgM也存在较强的交叉反应性;IgMμ链和重组μ链的各肽段免疫的血清与IgG均无明显的交叉反应性。结论重组的IgMμ链及其各肽段与天然IgMμ链有着相似的免疫原性和特异性,为基因工程得到抗人IgMμ链单克隆抗体奠定了研究基础。

IL-28B基因多态性在丙型肝炎患者治疗中的作用

Interleukin(IL)-28B(interferon lambda3,IFN-λ3)是一类属于IFN-λ家族的新型白介素,编码基因位于19号染色体上.近期的多项研究阐述了IL-28B的基因多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)在丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染者治疗上的重要性,并成功的定位了两个关联性最强的SNPs:rs12979860-IL-28B上游3kb处,rs8099917-IL-28B上游8kb处.IL-28B的基因多态性具有很好的临床应用前景,根据其基因型可以预测患者的自愈率,以及对聚乙二醇干扰素-α(PEG-IFN-α)和利巴韦林(ribavirin,RBV)联合治疗的持续应答率,从而有助于确定HCV感染者的个性化治疗方案.

人和羊IgG对噬菌体展示细菌免疫球蛋白结合分子单结构域随机组合文库的体外进化筛选

目的使用人和羊不同物种IgG来诱导噬菌体展示免疫球蛋白结合分子单结构域随机组合文库进行体外分子进化筛选,判断不同的Fc段构像是否具有特异的结合优势,同时探索其优势结合序列的组合特点。方法通过PCR获得金黄色葡萄球菌蛋白A(SpA)的A、B、D、E和链球菌(C和G群)蛋白G(SpG)的B2、B3各单结构域片段,构建由该6个片段随机组合的噬菌体展示文库。再分别使用人和羊IgG对文库进行体外亲和筛选,以期能够获得具有特异优势结合能力的组合分子,并在Phage ELISA的水平上进一步验证筛选结果。结果成功构建了符合进行体外进化筛选要求的噬菌体展示单结合结构域随机组合文库后,经过6轮人IgG诱导筛选,文库的展示片段大小统一为3个结构域组合分子,E-B-B3;经过6轮羊IgG诱导筛选,文库的展示片段大小也统一为4个结构域组合分子,D-A-B3-B3。Phage ELISA进一步验证最终组合序列的对人和羊IgG的结合能力。结论首次得到两种天然SpA、SpG分子中不存在的,且分别特异地与人和羊IgG具有强结合作用的新型组合分子E-B-B3、D-A-B3-B3,在人和羊IgG的纯化和检测具有很大的应用前景。

丙型肝炎的致病机制及药物治疗

丙型肝炎(丙肝)病毒(hepatitis C virus,HCV)可以通过几种途径影响宿主免疫功能,使病毒在宿主细胞内持续复制,最终导致HCV慢性感染。目前治疗慢性丙肝的方法主要是聚乙二醇干扰素和利巴韦林联合用法,此种疗法在HCV1型患者中约50%不能产生持续病毒学应答,且有不良反应。近年来,随着对HCV复制以及病毒非结构蛋白功能的深入研究,针对减少HCV载量的特异性药物的研发取得了较大进展。本文就HCV的细胞入侵、复制、逃避宿主的固有和获得性免疫及抗HCV临床试验药物的最新进展进行综述。

细胞膜微结构域中胆固醇对小鼠巨噬细胞摄取土拉弗朗西斯菌的作用

本文旨在探讨细胞膜微结构域中胆固醇在小鼠巨噬细胞摄取土拉弗朗西斯菌LVS株中的作用。用电穿孔法将穿梭质粒pFNLTP6gro-gfp导入土拉弗朗西斯菌LVS株;细胞胆固醇用菲律平Ⅲ染色,结合单克隆抗体的小窝蛋白-1用键合了Alexa594的羊抗鼠二抗显色;用Z轴电动聚焦的荧光显微镜分析土拉弗朗西斯菌LVS株感染;用甲基-β-环糊精干扰富含脂质的胞膜,损耗胆固醇,以评估膜微结构域的损伤对土拉弗朗西斯菌入侵的影响,菲律平Ⅲ用于检测胆固醇损耗的效果。结果显示,细胞胆固醇在早期与摄取的土拉弗朗西斯菌疫苗株共定位,膜微结构域相关成分小窝蛋白-1与两者接触密切;土拉弗朗西斯菌入侵巨噬细胞需要胆固醇丰富的膜结构域。结果提示,胆固醇丰富的膜微结构域和小窝蛋白-1在土拉弗朗西斯菌早期进入巨噬细胞过程中发挥重要作用。

丙型肝炎病毒诱发肝细胞肝癌的分子机制

肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是影响人类健康的恶性肿瘤之一,丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)是其主要致病因素之一。HCV诱发的HCC是由病毒和宿主免疫介导的多步骤复杂过程,从慢性炎症发展到肝硬化和肝癌,病毒和宿主因子共同参与此过程。其中,宿主基因突变是导致HCC发生的危险因素之一,全面了解HCV诱发HCC的分子机制将有助于解决此问题。

病毒穿越血脑屏障的两种方式与可能机制

血脑屏障是维持中枢神经系统内环境稳定的重要结构,限制血液中大多数病原体的入侵;但有些病毒可穿越血脑屏障入侵中枢神经系统,导致神经功能障碍及炎症性疾病。目前认为,病毒可通过细胞和细胞间隙两种方式穿越血脑屏障,前者为直接感染脑微血管内皮细胞和跨细胞途径,后者为破坏内皮细胞间紧密连接及"特洛伊木马"途径。本文就近年来病毒穿越血脑屏障的途径和机制进行综述。

α干扰素和利巴韦林抗丙型肝炎病毒作用的比较研究

α干扰素(IFN-α)联合利巴韦林是目前临床治疗丙型肝炎病毒(HCV)感染的标准方案。本研究以体外培养的感染性病毒HCVcc为研究对象,比较IFN-α和利巴韦林对HCV复制的影响,以及对干扰素调节因子9(IRF9)和干扰素刺激基因15(ISG15)等抗病毒基因的调节能力。结果显示,100u/mlIFN-α显著降低HCV RNA水平,利巴韦林剂量依赖性抑制HCV复制,且IFN-α联合利巴韦林对HCV复制及HCV NS3和E2蛋白表达具有协同抑制作用。5～80u/mlIFN-α剂量依赖性诱生IRF9和ISG15;1和5μg/ml利巴韦林不促进IRF9和ISG15水平升高;而利巴韦林联合IFN-α对两者亦无促进作用。

丙型肝炎病毒核心基因置换对病毒复制和感染影响的初步研究

本文旨在探讨丙型肝炎病毒(HCV)核心(core)蛋白在病毒复制和感染中的作用,采取基因置换的方法,用HCV1b型J4株的核心基因平行置换2a型J6JFH1株的核心区,构建了FL-J6JFH/J4core嵌合复制子。体外制备RNA转录体,以脂质体介导转染Huh7.5.1肝癌细胞。转染后第5天,用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测细胞内HCVRNA水平。第8天,以丙型肝炎患者血清为一抗,免疫荧光法(IFA)检测转染细胞内HCV蛋白表达。同时收集转染后第8天的细胞上清液,感染naveHuh7.5.1肝癌细胞,72h后IFA检测HCV蛋白表达。结果显示,FL-J6JFH/J4core转染组第5天细胞内RNA水平与野生型FL-J6JFH1接近,无显著差异(n=4,P>0.05)。免疫荧光检测显示,FL-J6JFH/J4core转染细胞后第8天及其上清液感染的naveHuh7.5.1细胞的HCV阳性细胞数都低于野生型。本研究结果初步表明,HCV各株间核心基因的替换会影响HCV的蛋白翻译和感染性病毒颗粒的产生与释放。

PTEN通过下调自噬活性抑制登革病毒2型感染

为探讨PTEN、细胞白噬与登革病毒2型(DENV-2)感染之间的关系及可能机制,本研究将DENV-2以不同感染复数(MOI)和不同持续时间感染人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC),蛋白免疫印迹法检测PTEN表达及指示细胞自噬的LC3型别转换情况;进一步构建pLenti-PTEN和pLenti-shPTEN表达质粒,包装成慢病毒,感染HUVEC以建立稳定表达细胞系,并检测PTEN过表达及敲低对自噬标记尤其是LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值、DENV-2 capsid蛋白和mRNA水平及子代病毒颗粒感染性的影响。结果显示,PTEN下调可抑制细胞自噬水平,继而降低DENV-2 capsid蛋白表达和子代病毒颗粒释放,提示DENV-2感染HUVEC发生的PTEN蛋白表达下调很可能是宿主细胞本身的一种针对DENV-2感染的保护性反应。

生物防御用DNA疫苗

近年的生物防御疫苗研究集中于DNA疫苗。DNA疫苗对人以及环境相对安全、经济，并且多价联合DNA疫苗还可以提供多重保护，因此有良好的研发前景和潜在的实用价值，但也存在免疫原性不强和接种方式有待改进等问题。此文就炭疽杆菌、埃博拉病毒、马尔堡病毒、猴痘病毒、天花病毒和委内瑞拉马脑炎病毒等几种被美国NIH和CDC列为重要生物战剂的DNA疫苗研发现状作一综述。

rpoB作为蜡样芽胞杆菌群快速检测的标志基因的实验研究

目的探讨常规PCR和实时荧光定量PCR(Q-PCR)方法检测蜡样芽胞杆菌群rpoB基因的特异性和敏感性。方法提取蜡样芽胞杆菌群和其他各种对照细菌的基因组DNA,合成蜡样芽胞杆菌群rpoB基因扩增引物,采用常规PCR和SYBRgreen实时定量PCR两种方法扩增rpoB基因片段,并将PCR产物克隆到pMD18-T载体后进行DNA测序。结果常规PCR和Q-PCR均能扩增出蜡样芽胞杆菌群rpoB基因的174bpDNA片段,而各种对照菌株均未见扩增。序列比对发现蜡样芽胞杆菌群细菌在该片段中存在5处核苷酸的不同,差异率为2.88%。以炭疽芽胞杆菌基因组DNA系列稀释作为扩增模板显示常规PCR最小检出量为3.42pg,Q-PCR的敏感性达到171fg,3次重复实验显示Q-PCR检测rpoB基因的灵敏度为(3.32×101±7.45×100)拷贝。结论以rpoB基因为检测靶基因的Q-PCR方法具有高度的特异性和良好的敏感性,能实现对蜡样芽胞杆菌群快速而准确的检测。

HCV 2a J6JFH细胞感染模型的建立及初步应用

目的建立能够自主复制的丙型肝炎病毒(HCV)体外细胞感染模型。方法制备HCV2a FL-J6JFH和阴性对照FL-J6JFH(GND)RNA转录体,分别转染Huh-7.5细胞,荧光定量PCR(FQ-PCR)检测细胞内HCV RNA水平,免疫荧光法(IFA)检测细胞内HCV蛋白的表达。以转染细胞上清液感染Na觙ve Huh-7.5细胞,检测HCV感染性病毒颗粒(HCVcc)的产生。将细胞用不同浓度的IFNα处理,观察所建立的细胞感染模型对IFNα的敏感性。结果转染后第5天,FL-J6JFH转染细胞内HCV RNA为1.2×106GE/μg RNA,第9天下降至最低水平,随后上升,于第13天达到最高值6.5×106GE/μg RNA,此后直至第59天,均保持在106GE/μg RNA左右,而FL-J6JFH(GND)转染细胞内HCV RNA则很快消失。FL-J6JFH转染的细胞内始终可以检测到HCV蛋白表达,而对照细胞内均未检测到。从第5天起,各时间点的FL-J6JFH转染细胞均能产生HCVcc。IFNα能够有效抑制HCVcc感染Huh-7.5细胞,并呈剂量依赖性。结论已成功建立了能持续产生HCVcc的HCV2a型体外细胞感染模型,IFNα能抑制FL-J6JFH HCVcc感染细胞中HCV RNA的复制,为研究HCV的结构与功能提供了实验平台。

ELISA方法检测肝癌血清标志物的应用

目的对已建立的肝癌血清标志物ELISA检测方法进行扩大规模临床样本检测,进一步评价和优化该方法。方法利用本实验室建立的肝癌血清标志物ELISA检测方法,对407份肝病患者血清和95份正常献血员血清进行检测,并对检测结果进行分析。结果324份HBV感染后的肝癌、肝硬化及肝炎患者血清样本中,2种或2种以上指标阳性比例分别为77.6%、76.1%和52.5%,肝癌患者3种或3种以上指标阳性比例较肝硬化和肝炎患者分别高39.9%和310%;在正常献血员、药物性肝炎、酒精性肝炎及其他类型的癌症患者中,87.5%～100%的患者肝癌血清标志物分子≤1种;URG7是最早出现的抗体阳性标志物分子,URG11和S15a抗体则在进展后期或已发展为肝癌的患者血清中呈优势比例出现。结论5种肝癌血清标志物分子与肝癌发生的风险呈正相关,已建立的肝癌血清标志物ELISA检测方法可用于肝癌高危人群的筛选及小肝癌的早期诊断,作为目前AFP和MRI诊断方法的有益补充。