献血者HCV RNA实时荧光定量PCR方法的建立

目的建立快速检测献血者中丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染的方法。方法利用体外转录制备的HCV RNA转录体进行病毒RNA抽提方法及抽提效率的比较;将RNA转录体与正常血清进行不同数目的混合,对最佳混合标本数进行了摸索;建立HCV荧光定量PCR方法(fluorescence quantitative PCR,FQ-PCR),并对献血者进行混合标本HCV核酸检测。结果确定了比较理想的病毒RNA抽提方法;用于HCV核酸检测的混合标本数为24例;建立的荧光定量PCR方法能最低检测出10个copies/ml;采取24例混合血标本方法,FQ-PCR检测HCV RNA,576例ELISA检测HCV阴性的献血者未检测出HCV RNA。结论初步建立了献血者HCV感染的混合标本荧光定量PCR检测方法。

IL-28B基因多态性在丙型肝炎患者治疗中的作用

Interleukin(IL)-28B(interferon lambda3,IFN-λ3)是一类属于IFN-λ家族的新型白介素,编码基因位于19号染色体上.近期的多项研究阐述了IL-28B的基因多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)在丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染者治疗上的重要性,并成功的定位了两个关联性最强的SNPs:rs12979860-IL-28B上游3kb处,rs8099917-IL-28B上游8kb处.IL-28B的基因多态性具有很好的临床应用前景,根据其基因型可以预测患者的自愈率,以及对聚乙二醇干扰素-α(PEG-IFN-α)和利巴韦林(ribavirin,RBV)联合治疗的持续应答率,从而有助于确定HCV感染者的个性化治疗方案.

丙型肝炎病毒诱发肝细胞肝癌的分子机制

肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是影响人类健康的恶性肿瘤之一,丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)是其主要致病因素之一。HCV诱发的HCC是由病毒和宿主免疫介导的多步骤复杂过程,从慢性炎症发展到肝硬化和肝癌,病毒和宿主因子共同参与此过程。其中,宿主基因突变是导致HCC发生的危险因素之一,全面了解HCV诱发HCC的分子机制将有助于解决此问题。

病毒穿越血脑屏障的两种方式与可能机制

血脑屏障是维持中枢神经系统内环境稳定的重要结构,限制血液中大多数病原体的入侵;但有些病毒可穿越血脑屏障入侵中枢神经系统,导致神经功能障碍及炎症性疾病。目前认为,病毒可通过细胞和细胞间隙两种方式穿越血脑屏障,前者为直接感染脑微血管内皮细胞和跨细胞途径,后者为破坏内皮细胞间紧密连接及"特洛伊木马"途径。本文就近年来病毒穿越血脑屏障的途径和机制进行综述。

HCV 2a J6JFH细胞感染模型的建立及初步应用

目的建立能够自主复制的丙型肝炎病毒(HCV)体外细胞感染模型。方法制备HCV2a FL-J6JFH和阴性对照FL-J6JFH(GND)RNA转录体,分别转染Huh-7.5细胞,荧光定量PCR(FQ-PCR)检测细胞内HCV RNA水平,免疫荧光法(IFA)检测细胞内HCV蛋白的表达。以转染细胞上清液感染Na觙ve Huh-7.5细胞,检测HCV感染性病毒颗粒(HCVcc)的产生。将细胞用不同浓度的IFNα处理,观察所建立的细胞感染模型对IFNα的敏感性。结果转染后第5天,FL-J6JFH转染细胞内HCV RNA为1.2×106GE/μg RNA,第9天下降至最低水平,随后上升,于第13天达到最高值6.5×106GE/μg RNA,此后直至第59天,均保持在106GE/μg RNA左右,而FL-J6JFH(GND)转染细胞内HCV RNA则很快消失。FL-J6JFH转染的细胞内始终可以检测到HCV蛋白表达,而对照细胞内均未检测到。从第5天起,各时间点的FL-J6JFH转染细胞均能产生HCVcc。IFNα能够有效抑制HCVcc感染Huh-7.5细胞,并呈剂量依赖性。结论已成功建立了能持续产生HCVcc的HCV2a型体外细胞感染模型,IFNα能抑制FL-J6JFH HCVcc感染细胞中HCV RNA的复制,为研究HCV的结构与功能提供了实验平台。

ELISA方法检测肝癌血清标志物的应用

目的对已建立的肝癌血清标志物ELISA检测方法进行扩大规模临床样本检测,进一步评价和优化该方法。方法利用本实验室建立的肝癌血清标志物ELISA检测方法,对407份肝病患者血清和95份正常献血员血清进行检测,并对检测结果进行分析。结果324份HBV感染后的肝癌、肝硬化及肝炎患者血清样本中,2种或2种以上指标阳性比例分别为77.6%、76.1%和52.5%,肝癌患者3种或3种以上指标阳性比例较肝硬化和肝炎患者分别高39.9%和310%;在正常献血员、药物性肝炎、酒精性肝炎及其他类型的癌症患者中,87.5%～100%的患者肝癌血清标志物分子≤1种;URG7是最早出现的抗体阳性标志物分子,URG11和S15a抗体则在进展后期或已发展为肝癌的患者血清中呈优势比例出现。结论5种肝癌血清标志物分子与肝癌发生的风险呈正相关,已建立的肝癌血清标志物ELISA检测方法可用于肝癌高危人群的筛选及小肝癌的早期诊断,作为目前AFP和MRI诊断方法的有益补充。

靶向丙型肝炎病毒生命周期的新型抗病毒治疗靶点

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)是血液传播的球形包膜病毒,编码单正链RNA,是黄病毒科成员。目前,全世界约有1.7亿患者感染丙型肝炎病毒,每年有300万的新增感染病例,我国HCV感染者近4 000万。HCV慢性化程度高,约80%的急性感染者将发展为慢性肝脏疾病,其中又有约20%将最终进展到肝硬化。

人类免疫缺陷病毒1型Tat蛋白N末端缺失突变体融合蛋白的表达及其免疫原性分析

本研究采用PCR方法从人类免疫缺陷病毒1型(Human immunodeficiency virus 1,HIV-1)HXB2株tat基因中扩增编码Tat蛋白N末端1-21位氨基酸缺失的突变体Tat22-101基因片段,构建其原核表达质粒pET32a-Tat22-101,经双酶切及测序验证后,转化大肠埃希菌BL21(DE3),进行IPTG诱导表达及Ni^(2+)-NTA柱亲和层析纯化。纯化后的突变体融合蛋白PET32a-Tat22-101经SDS-PAGE及Western blotting鉴定,其相对分子质量约为26.9kD。该融合蛋白免疫BALB/c小鼠,经ELISA检测结果表明,pET32a-Tat22-101融合蛋白不仅较好地保留其免疫原性,而且能诱导产生高滴度的针对Tat N末端区之外的Tat其他功能区表位的抗体,为进一步研究Tat生物学功能和研制新型HIV Tat疫苗奠定试验基础。

合成多肽抗原检测原发性肝癌血清标志物ELISA方法的建立及应用

目的建立用合成多肽抗原检测原发性肝癌血清标志物的ELISA方法,并进行初步应用。方法利用筛选的5种与乙型肝炎病毒X抗原(HBx)诱导肝癌相关的细胞蛋白URG4、URG7、URG11、S15a和Sui1,作为原发性肝癌的筛查和早期诊断的血清标志物,根据上述蛋白的序列合成多肽(L4A/L4B、L7B、L11-1/L11-3/L11-4、L12A/L12B和Sui1A/Sui1B),作为检测抗原,建立检测相应抗体的间接ELISA法,并进行敏感性、特异性、精密性评价及临床应用。结果所建立的间接ELISA法敏感性为93.8%,特异性为97.9%,试验内和试验间变异系数分别为3.8%～5.6%和7.4%～10.3%;检测161份肝癌、肝硬化及乙型肝炎患者血清样本中,1种指标以上阳性检出率分别为90.4%、92.6%和61.7%,2种指标以上阳性检出率分别为78.6%、70.6%和48.3%;39份正常献血员血清中,1种指标以上阳性检出率为12.2%,2种指标以上阳性检出率为6.3%。结论所建立的ELISA法可作为目前的AFP和核磁共振诊断方法的有益补充,用于原发性肝癌高危人群的筛选和小肝癌的早期诊断。

小鼠截短型可溶性腺苷酸环化酶基因的克隆表达及活性鉴定

目的克隆表达小鼠截短型可溶性腺苷酸环化酶(mtsAC)基因,并检测其活性,为后续研究提供技术平台。方法Trizol法提取小鼠睾丸组织总RNA,RT-PCR法扩增mtsAC基因,经测序正确后,克隆至真核表达载体pcDNA4-V5,转染HEK293T细胞,Western blot及免疫荧光染色法检测目的蛋白的表达,并检测HEK293T细胞中cAMP的水平。结果所构建的重组表达质粒pcDNA4-V5-mtsAC经酶切和测序证明构建正确,插入的mtsAC基因长度为1549bp;表达的重组mtsAC蛋白相对分子质量为48000,在胞浆及胞核中呈均一性表达;转染质粒pcDNA4-V5-mtsAC的HEK293T细胞中cAMP的水平较未转染的HEK293T细胞升高约17倍,并可被NaHCO3和CaCl2激活。结论已成功克隆了mtsAC基因,并在HEK293T细胞中表达了具有活性的重组mtsAC蛋白,建立了可用于mtsAC特性研究及男性不育药物筛选的技术平台。

宿主细胞硫氧还蛋白互作蛋白与丙型肝炎病毒感染的相互作用研究

目的：探究宿主细胞硫氧还蛋白互作蛋白（TXNIP）与 HCV 复制的关系以及 TXNIP 促进HCV 复制的分子机制。方法利用转录组芯片和转录组深度测序技术对细胞培养的 HCV（HCVcc）感染的 Huh7细胞进行转录组分析，并通过反转录-实时荧光定量 PCR 和高通量测序差异表达的 TXNIP 进行细胞差异表达验证；同时观察 TXNIP 表达水平对 HCV 感染的影响。结果转录组芯片检测发现， HCVcc 感染的 Huh7细胞中 TXNIP mRNA 较未感染的对照细胞上调约3．7倍；转录组深度测序表明， TXNIP mRNA 在 HCVcc 感染后36、60 h 均明显上调（t 值分别为24．90、8．27，均 P 〈0．01）；细胞实验证明，小干扰 RNA（siRNA）干扰 TXNIP 表达可降低 HCVcc 感染，而过表达 TXNIP 可促进 HCV 感染；HCV 感染可诱导 Huh7细胞 TXNIP 上调而不能诱导 Huh7．5．1细胞 TXNIP 上调；α干扰素、β干扰素和λ干扰素处理细胞均可上调 TXNIP 的表达。结论 HCV 感染诱导 TXNIP 表达上调，而 TXNIP 表达上调可促进 HCV 复制，宿主蛋白 TXNIP 在 HCV 复制、感染及免疫逃逸中具有重要作用。

肠道病毒71型复制周期研究进展

人类肠道病毒71型（enterovirus 71,EV71）属于小RNA病毒科肠道病毒属。自1969年首次从美国加利福尼亚1名患有中枢神经系统疾病的手足口病婴儿粪便样本中分离出EV71病毒以来,手足口病在世界各地曾多次出现大流行,多发于5岁以下儿童,可引起发热和口腔、手、足部的溃疡或斑疹等症状。少数患儿可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等并发症。如果病情发展快,导致重症患儿死亡[1]。

人SR-BI基因表达抑制慢病毒载体构建及其稳定细胞株的筛选

目的建立SR-BI表达抑制的肝癌细胞系,以作为研究SR-BI基因突变对HCV感染性影响的细胞模型。方法构建SR-BI短发夹状RNA(Short hairpin RNA,sh RNA)慢病毒重组质粒Lv-SR-BI-sh RNA,挑取克隆进行PCR扩增和序列测定;将阳性重组质粒与慢病毒辅助质粒共转染HEK2973T细胞,包装SR-BI sh RNA慢病毒并进行病毒滴度测定。SR-BI sh RNA慢病毒感染人肝癌细胞株Huh7和Huh7.5.1细胞,嘌呤霉素筛选,Real-time PCR和Western blot法检测SR-BI m RNA转录和蛋白表达。结果测序结果证实Lv-SR-BI-sh RNA慢病毒载体构建成功并获得HEK293T细胞中包装的慢病毒,Lv-SR-BI-sh RNA重组慢病毒感染Huh7和Huh7.5.1细胞,感染组SR-BI m RNA转录降低,蛋白表达降低。结论建立了SR-BI表达抑制的人肝癌细胞株Huh7-si SR-BI和Huh7.5.1-si SR-BI稳定细胞系。

丙型肝炎病毒构象性表位与乙型肝炎病毒S基因嵌合表达质粒的构建及其表达

目的构建丙型肝炎病毒(HCV)构象性表位AR3与乙型肝炎病毒S抗原(HBs)嵌合的真核表达质粒,并在293T细胞中表达鉴定。方法采用重叠拼接PCR法,将HCV AR3表位的基因插入pSVB-24H质粒中,构建pSVB-24H-AR3重组质粒;再用PCR法扩增出全长的AR3-S嵌合基因,将其克隆到pCMV-HA载体中,构建pCMV-HA-AR3-S真核表达质粒。脂质体和PEI转染法导入293T细胞,Western blot和ELISA法分别检测重组蛋白的表达及分泌情况。结果 PCR法分别扩增出pSVB-24H部分载体、HCV AR3及HBs部分基因共3条基因片段;利用两步重叠拼接PCR,扩增得到1 118bp的三片段拼接产物,双酶切鉴定重组质粒pSVB-24H-AR3位置正确,测序分析表明插入序列及开放读码框正确,但细胞表达产物难以被抗-HBs识别;将完整的1 128bp的AR3-S基因插入带HA标签的表达载体中,酶切鉴定和测序分析表明重组质粒pCMV-HA-AR3-S构建正确,Western blot结果显示重组AR3-S蛋白可与HA抗体特异性反应;ELISA结果也显示细胞内能检测到较高水平的AR3-S重组蛋白。结论成功构建pSVB-24H-AR3和pCMV-HA-AR3-S嵌合表达质粒并在细胞中表达,为后续开展基于HBs的病毒样HCV颗粒疫苗研究提供了实验依据。

丙型肝炎病毒包膜蛋白E2中关键组氨酸位点突变体的构建与感染性

目的构建组氨酸(Histidine)位点突变的丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)突变体,并检测其感染性。方法利用定点突变技术,分别将HCV包膜蛋白E2第490位和第621位的组氨酸突变为丙氨酸(Alanine),构建突变质粒H490A和H621A,采用T7体外转录法制备病毒RNA,通过电穿孔法导入Huh7.5.1细胞,免疫荧光法检测病毒蛋白的表达、电穿孔效率及细胞培养上清的感染性。结果 H490A和H621A突变型质粒经酶切及测序鉴定构建正确;体外转录获得的野生型与突变型病毒RNA均能在Huh7.5.1细胞中表达病毒蛋白,电穿孔效率高达90%以上;野生型病毒感染细胞培养上清中可检测到HCV阳性细胞,H490A病毒感染细胞培养上清中的阳性细胞数量比野生型明显减少,H621A病毒感染细胞培养上清中未检测到阳性细胞。结论成功构建了组氨酸位点突变的全长表达质粒H490A和H621A,两种突变体病毒的感染性均显著降低。

聚集性丙型肝炎病毒感染者外周血病毒载量与肝功能以及病毒包膜蛋白抗体水平关系的研究

HCV为黄病毒科成员，是有包膜的单股正链RNA病毒，主要经血液传播，引起人类肝炎、肝硬化和肝细胞癌等疾病。HCV感染是严重的全球性公共卫生问题，目前全球HCV感染者达1．7亿，每年新发丙型肝炎患者30万～40万。我国HCV感染者约有1000万，近10年来呈逐年上升趋势。

干扰素诱导的MxA蛋白及其抗丙型肝炎病毒感染作用的研究进展

干扰素α(Interferon α,IFNα)是目前公认的可有效抗丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)的药物,其主要通过诱导细胞产生抗病毒蛋白而发挥作用。抗黏病毒蛋白A(Mixovirus resistance protein A,MxA)是由I型IFN诱导产生的相对分子质量为78000的抗病毒蛋白,主要分布于细胞质中,具有识别HCV核糖核蛋白复合物(Virus ribonucleoprotein complexes,vRNPs)的功能,通过MxA的GTP酶活性水解HCV核衣壳,使病毒核酸释放并被胞浆中的核酸内切酶降解。本文主要对IFN的分类、MxA的结构和作用机制及近年来MxA抗HCV感染作用的研究进展作一综述。

丙型肝炎无干扰素全口服治疗临床Ⅲ期试验进展

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV）为黄病毒属的单股正链RNA病毒,主要通过血液传播,慢性化程度高。目前的标准治疗是聚乙二醇干扰素（pegylated IFN-α）联合利巴韦林（ribavirin,RBV）。自1989年首次鉴定出HCV以来[1],HCV的干扰素治疗虽然有缓慢的进展,如长效干扰素的使用,但仍无法摆脱其不良反应多、持续病 毒学应答率（sustained virologic response，SVR）不够高及使用不便等缺点。近几年，丙型肝炎的抗病毒治疗研究突飞猛进。