B淋巴细胞刺激因子及其受体与多发性骨髓瘤关联性的临床实验诊断研究

目的:探讨B细胞激活因子(BLyS)及其受体在多发性骨髓瘤(MM)发病中的作用机制。方法:用酶联免疫吸附测定法(ELISA)和实时荧光定量聚合酶链反应(RFQ-PCR),对19例MM患者和30名健康人血清BLyS含量、外周血单个核细胞(PBMCs)中BLyS及其受体mRNA含量进行检测;并比较MM患者血清BLyS含量与外周血BLyS及其受体基因表达水平和免疫球蛋白(IgG、IgA、IgM)浓度、乳酸脱氢酶(LDH)、轻链(kap、lam)的相关性。结果:MM患者血清BLyS含量[(7.95±4.93)g/L]明显高于健康对照组[(2.70±1.09)g/L,P<0.01],并与LDH浓度呈正相关性(r=0.734,P<0.001);97.4%(18/19),84.2%(16/19)的MM患者PBMCs中BLyS、BCMA mRNA表达水平较正常人明显增高,并且也与LDH的含量呈正相关;而47.32%(9/19)患者TACI mRNA表达水平降低。结论:MM患者的血清BLyS蛋白浓度和PBMCs中BLyS及其受体基因表达水平有异常改变,说明BLyS及其受体可能参与MM的发病;BLyS及其受体表达水平也许可作为预后的一个指标。

自身免疫肝病患者抗中性粒细胞胞浆抗体的检测及临床意义

探讨抗中性粒细胞胞浆抗体（anti-neutrophil cytoplastic antibodies,ANCA）对自身免疫肝病的临床意义。应用间接免疫荧光法和斑点法检测149例自身免疫性肝病患者[自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis,AIH）患者57例,原发性胆汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis,PBC）患者42例,不明原因肝损患者50例]的ANCA和抗可提取性核抗原抗体（extract-able nuclear antigen,ENA）,进而用ELISA法分析60例ANCA阳性的自身免疫肝病患者的ANCA抗原谱。以200例健康献血员为正常对照。结果ANCA在AIH、PBC、不明原因肝损中的阳性率分别为81%、40%、30%,其中非典型性pANCA的阳性率依次为70%、40%、28%。AIH组与PBC组及AIH组与不明原因肝损组间非典型性pANCA的阳性率有显著性差异（P〈0.01）,但PBC组与不明原因肝损组间差异不显著（P〉0.05）。各疾病组ANCA抗原谱如下：AIH组中,乳铁蛋白3%阳性,MPO 11%阳性,组织蛋白酶G和BPI的阳性率分别为11%、17%;PBC组中,弹性蛋白酶和组织蛋白酶G阳性率均为5%,BPI的阳性率为16%;不明原因肝损组中,BPI阳性率为17%。大多数自身免疫性肝病患者非典型性pANCA为阳性（28%-70%）,且伴有特征性自身抗体。注重非典型性pANCA的检测对明确诊断自身免疫肝病及其分类有很大的帮助。

自身免疫性肝病148例临床特点分析

目的分析自身免疫性肝病(autoimmune liver diseases,ALDS)的临床、生化及自身抗体特点。方法分析我院1996年-2005年148例ALDS患者其中自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis,AIH)患者52例,原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosi,PBC)患者96例的临床表现,并分析有关实验室检查资料。结果两组患者临床症状均不典型,肝功能各项指标普遍异常,AIH组以ALT升高更为明显,而PBC组患者ALP和GGT升高更为显著(P<0.01)。在自身抗体检测情况两组有极大的差异。AIH患者主要以高效价的抗核抗体(antinuclear antibodies,ANA)(44/52)和/或抗平滑肌抗体(antismooth muscle antibodies)(35/52)为主,此外,尚有9.6%(5/52)和3.8%(2/52)的AHI患者出现抗可溶性肝抗原抗体(auti-soluble liver antigen autoantibdies,抗SLA)和抗肝/肾微粒体(liver/kidney microsomal,LKM)抗体阳性。PBC组以抗线粒体抗体(mitahondrial anto-antibodies,AMA)阳性(99.0%)为主,93.8%的患者AMAM2阳性。结论AIH及PBC的诊断可结合临床、生化、自身抗体检查的结果,其中自身抗体的检测尤为重要。

原发性胆汁性肝硬化85例实验室检测指标的分析

目的探讨原发性胆汁性肝硬化(PBC)的免疫学实验诊断特点。方法观察85例PBC患者的临床表现,并分析有关实验室检查资料。结果本组患者临床症状不典型。所有患者γ-谷氨酰转移酶(GGT)升高,98.8%(84/85)的患者碱性磷酸酶(ALP)升高,87.1%(74/85)的患者总胆红素(TB il)和结合胆红素(CB il)升高,81.2%(69/85)的患者丙氨酸转氨酶(ALT)、78.8%(67/85)的患者门冬氨酸转氨酶(AST)、52.9%(45/85)的患者球蛋白(GLB)、95.7%(22/23)的患者总胆汁酸(TBA)、84.0%(21/25)的患者高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)升高。自身抗体检测有59例抗核抗体(ANA)阳性(69%),其中32例为核膜型,20例为着丝点型;85例患者抗线粒体抗体(AMA)均为阳性,其中80例(94.1%)AMA M2阳性。结论PBC无典型性临床症状,医生可以通过临床表现结合AMA,尤其是AMA M2的检测结果获得诊断信息。

自身免疫性肝病患者外周血细胞亚群表型分析

目的 分析自身免疫性肝病患者外周血细胞亚群表型变化情况。方法 用流式细胞仪检测 35例原发性胆汁性肝硬化(primarybiliarycirrhosis,PBC)、19例自身免疫性肝炎 (autoimmunehepatitis,AIH)、2 1例乙型肝炎患者以及 30例正常人外周血单个核细胞 (peripheralbloodmononuclearcell,PBMC)中的NK、CD3+ 、CD4 + 、CD8+ 、CD2 8+ 、CD8+ /CD2 8+ 、Fas、FasL的水平并加以分析比较。结果 PBC组患者的CD4 + 亚群较正常组升高 ,而CD8+ /CD2 8+ 细胞亚群较正常组、乙肝组和AIH组减低。AIH组患者的CD4 + 和CD8+ /CD2 8+ 细胞均较正常组升高。PBC组和AIH组患者的Fas和FasL的表达均高于正常组。结论 自身免疫性肝病患者存在T细胞亚群异常 ,细胞凋亡活跃 ,提示T细胞介导的免疫紊乱在自身免疫性肝病的免疫损伤机制中起重要作用。

冠心病患者外周血单个核细胞Toll样受体4表达的测定及临床意义

目的:观察Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)在冠心病患者外周血单个核细胞(PBMCs)的表达水平,并探讨其与冠状动脉粥样硬化发生发展的关系。方法:流式细胞术检测50例冠状动脉粥样硬化性心脏病(CAD)患者及40例健康对照者PBMCs TLR4的表达;生化常规测定所有入选者血脂水平;应用TaqMan荧光探针技术建立实时荧光定量RT-PCR方法,在GeneAmp 5700型检测仪上测定了入选对象PBMCs中TLR4 mRNA的含量。结果:PBMCs的阳性率为(29.5±7.9)%,显著高于健康对照组的阳性率[(23.4±7.7)%,P<0.01];冠心病组TLR4 mRNA的平均拷贝数显著高于健康对照组[(5.3±3.8)×106vs(1.8±1.4)×106,P<0.01];而冠心病血脂正常组和血脂异常组的TLR4阳性率和mRNA平均拷贝数均无明显差异。结论:TLR4主要表达于外周血单个核细胞,在CAD患者中其阳性率升高;CAD患者TLR4 mRNA的含量显著高于健康对照组;TLR4的阳性率和mRNA含量高低与血脂无关;TLR4及其介导的天然免疫应答与动脉粥样硬化的发生发展存在一定的相关性。

IL-22在原发性胆汁性肝硬化中的表达及其临床意义

目的探讨原发性胆汁性肝硬化（PBC）外周血中IL-22的表达水平及其临床意义。方法采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测PBC患者血清中IL-22水平；全自动生化仪检测TBIL，γ-GT；并以健康体检者为对照组。结果40例PBC患者血清中IL-22水平（810．36±30．52pg／m1）明显高于健康对照组（361．51±30．52pg／ml，P〈0．05），且IL-22水平与TBIL和γ-GT呈显著正相关（r=0．386，P〈0．05；r=0．356，P〈0．05）。结论IL-22可能参与了PBC的发病机制，并可能成为一个潜在的治疗靶点。

原发性胆汁性肝硬化患者B淋巴细胞刺激因子基因表达的测定及临床意义

目的建立检测人B淋巴细胞刺激因子(BLyS)mRNA的相对定量方法,探讨其基因表达水平与原发性胆汁性肝硬化(PBC)的相关性。方法基于TaqM an-MGB探针技术,以18SrRNA为内参照,通过目的基因与内参基因荧光强度达到一定阈值时的循环数之差(△CT值)定量原始模板浓度,建立实时荧光逆转录聚合酶链反应(FQ-RT-PCR)相对定量方法,检测30名正常人和40例PBC患者外周血单个核细胞(PBMC)BLyS基因的表达。结果PBC患者外周血单个核细胞BLyS mRNA表达的△CT值为9.5±2.5,与正常对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01),其原始模板浓度为正常对照组的4.3倍。PBC患者中抗核抗体(ANA)阳性占80%;其中ANA 1∶100组BLyS检测的△CT为11.4±0.9,与正常对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05);而ANA 1∶1 000和ANA 1∶10 000组BLyS的△CT值与正常对照组比较,差异有统计学意义(P<0.001),两组间△CT值比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论PBC患者PBMC BLyS mRNA表达水平明显升高,且与ANA滴度相关。

结直肠癌组织中ECM1基因水平的测定及临床意义

目的:探讨细胞外基质蛋白1基因在结直肠癌中的表达及其意义.方法:基于TaqMan-MGB荧光探针技术,建立实时荧光定量RT-PCR方法,检测正常结直肠黏膜组织(n=46),结直肠腺瘤(n=18),结直肠癌(淋巴结未转移)(n=25)和结直肠癌(淋巴结转移)(n=21)中ECM1基因的表达.结果:正常黏膜,腺瘤组织,结直肠癌(淋巴结未转移)组织和结直肠癌(淋巴结转移)组织中ECM1基因的表达均值分别为(9.81±3.16)×10~8拷贝/g RNA,(10.1±3.65)×10~8拷贝/g RNA,(6.89±2.96)×10~9拷贝/g RNA,(5.01±2.22)×10^(10)拷贝/g RNA.正常黏膜和腺瘤组织组间无明显差异(P>0.05);结直肠癌(淋巴结未转移)组明显高于正常黏膜和腺瘤组织组P<0.01);结直肠癌(淋巴结转移)组明显高于其他三组(P<0.01).结论:ECM1基因在结直肠癌中表达升高,并且与结直肠癌的转移相关.

增殖诱导配体在自身免疫病患者外周血中的表达

为检测增殖诱导配体(APRIL)在自身免疫病(SLE和RA)患者中的表达情况以及它与B细胞刺激因子(BAFF)表达、疾病预后、抗-dsDNA抗体之间的相关性。收集58名自身免疫病患者以及20名健康对照的外周血,用实时定量RT-PCR方法检测PBMC中APRIL和BAFF mRNA的表达,用ELISA方法检测血浆中APRIL和BAFF蛋白水平。同时,检测血浆中IgG、IgA、IgM、BF和抗-dsDNA抗体水平。结果同对照组相比,APRIL mRNA水平在自身免疫病患者中显著升高,与BAFF mRNA表达水平有相关性。与疾病初发组和治疗后缓解组相比,治疗后来缓解组患者APRIL mRNA表达显著升高。疾病组外周循环中BAFF蛋白显著升高,APRIL蛋白未见升高,APRIL和BAFF之间未见显著意义相关性,A-PRIL蛋白与抗-dsDNA和疾病活动度之间未见显著相关。检测APRIL mRNA含量是判断自身免疫病患者治疗情况和疾病预后的有用指标。循环中APRIL和BAFF蛋白的产生可能受到不同机制调节,在自身免疫病的发生、发展以及转归中所起的作用也不同,为研究APRIL的产生机制、表达水平和自身免疫病程度、早期诊断、预后等的关系打下基础。

自身抗原PDC-E2融合蛋白在大肠杆菌中的表达及免疫学鉴定

目的用基因工程的方法克隆表达丙酮酸脱氢酶复合体E2(PDC-E2)融合蛋白,以用于人原发性胆汁性肝硬化(PBC)的早期发现和临床诊断。方法针对PDC-E2的cDNA序列设计引物,从正常人的淋巴细胞中提取RNA,通过反转录PCR方法扩增得到相应的基因片段,经测定序列验证后插入表达载体pET28a(+),构建重组表达载体pET28a(+)-PDC-E2,转化大肠杆菌BL21(DE3)后诱导表达蛋白质。表达蛋白经SDS-PAGE、Western blot鉴定。结果经核苷酸序列测定和酶切鉴定结果表明,成功地构建了PDC-E2重组质粒。IPTG诱导表达后,获得PDC-E2融合蛋白。经免疫学鉴定,重组抗原片段具有抗线粒体抗体二亚型(AMA-M2)的免疫原性。结论获得PBC特异性靶抗原的多肽片段,为PBC的早期发现和临床诊断提供有力工具。

用重组丙酮酸脱氢酶复合物E2亚单位检测M2抗体及其临床意义

目的用重组表达的丙酮酸脱氢酶复合物E2亚单位(PDC-E2)检测M2抗体,以利于原发性胆汁性肝硬化(PBC)的早期诊断。方法采用重组表达的PDC-E2建立了免疫印迹法(IBT)和酶联免疫吸附试验(ELISA)。检测40例PBC患者血清的M2抗体,以其他肝病患者、自身免疫病患者、健康体检者作对照。结果40例PBC患者血清中检测出抗PDC-E2抗体阳性37例,阴性3例,阳性率为92.5%,而疾病对照组和健康体检者血清中该抗体检测均为阴性。结论用重组表达的人PDC-E2检测抗体有较好的敏感性和特异性,有助于PBC的临床诊断。

实时定量PCR检测自身免疫中APR IL mRNA表达

建立检测增殖诱导配体(a proliferation-inducing ligand,APRIL)mRNA的SYBR GreenⅠ实时定量PCR方法,了解自身免疫性疾病[系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎(RA)]患者外周血单个核细胞(PBMC)中APRIL的表达水平,研究APRIL mRNA的表达与自身免疫性疾病发病机制、预后之间的关系。方法构建克隆载体pGEM-T Easy-APRIL作为定量模板,Line Gene FQD-33A荧光定量PCR仪定量检测58例自身免疫性疾病(SLE、RA)确诊病人和20例正常健康献血者的外周血APRIL mRNA表达含量,以APRIL mRNA和内参GAPDH mRNA含量比值作为APRIL表达水平的指标。结果58例自身免疫病患者的APRIL mRNA表达范围3.95～192,均值为29.68±4.5。20例正常对照标本PBMC APRIL mRNA的表达范围3.1～18.7,均值为10.56±2.0。自身免疫病患者外周血中APRIL mRNA的表达水平高于正常对照组,其中久治不愈或疗效差者APRIL mRNA表达水平明显高于初发患者及治疗后缓解患者,但后两组差异无显著性意义。结论成功建立了人APRIL基因表达含量的SYBR GreenⅠ实时定量检测方法。自身免疫性疾病(SLE、RA)患者的APRIL mRNA的表达含量升高,其中疗效差久治不愈患者有更高表达水平。研究APRIL表达和自身免疫病发展、早期诊断、预后等相关性,为寻找自身免疫病治疗新靶点打下基础。

免疫电泳和双向电泳技术的发展和应用

1937年电泳技术的鼻祖Tiselius教授建立了最早期的移界电泳用于蛋白质分离与鉴定,开创了现代电泳技术的新纪元.随着各种电泳新技术的发展,电泳和其他技术的结合,以及各种先进的电泳仪的不断出现,使得许多与蛋白质结构和功能有关的研究得以飞速发展.本文主要就近年来备受关注的免疫电泳和双向电泳技术的发展和应用做一评述.

原发性胆汁性肝硬化患者外周血单个核细胞中趋化因子及其受体CCR6 mRNA的表达及其临床意义

目的探讨原发性胆汁性肝硬化(PBC)患者外周血单个核细胞(PBMCs)中CC型趋化因子配体20(CCL20)和CC型趋化因子受体6(CCR6)mRNA的表达及临床意义。方法采用TaqMan荧光探针技术,建立实时荧光定量PCR的方法,分别检测50例PBC患者、50例乙型肝炎肝硬化患者及50例健康对照者PBMCs中CCL20和CCR6 mRNA的表达水平。结果 PBC患者中CCL20和CCR6的mRNA表达显著高于健康对照组和疾病对照组(P<0.01);并根据临床不同分期检测后发现,PBC患者中Ⅲ、Ⅳ期CCL20和CCR6 mRNA的表达较Ⅰ、Ⅱ期明显升高(P<0.05)。结论 PBC患者CCL20和CCR6 mRNA的表达与PBC的发生发展存在一定的相关性,可能参与PBC的调控机制,从而可能为PBC的诊断和预防提供一定的线索。

B淋巴细胞激活因子及其受体mRNA与系统性红斑狼疮关联性研究

目的:研究建立实时荧光定量(RFQ)-PCR法测定B淋巴细胞激活因子(BLyS)及其受体mRNA含量的方法,探讨其在系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血单一核细胞(PBMC)中表达的检测价值。方法:在BLyS及其受体基因保守区设计特异性的引物和荧光探针,用反转录(RT)-PCR扩增目的片段实时检测产物的荧光强度,用所建立的RFQ-PCR方法检测23例SLE患者、23名正常人外周血BLyS及其受体mRNA表达。结果:SLE患者B淋巴细胞成熟抗原(BCMA)、穿膜蛋白活化物(TACI)和B淋巴细胞活化因子受体(BAFF)-RmRNA的表达明显高于正常人(P<0.01),活动期患者的表达高于缓解期(P<0.01),抗ds-DNA抗体阳性和尿蛋白阳性的SLE患者BCMA、TACI和BAFF-RmRNA的表达高于阴性患者(P<0.01)。结论:RFQ-PCR检测BLyS及其受体mRNA含量的方法具有较好的灵敏度和重复性;SLE患者BLyS、TACI和BAFF-RmRNA表达含量升高,提示BLyS、TACI和BAFF-R可能与SLE的发病有关。

人B细胞活化因子基因启动子活性研究

为探索与自身免疫病发病密切相关的B细胞活化因子(BAFF)基因高水平转录的启动序列及IFN-γ等炎性细胞因子对其活性的影响,以人BAFF基因转录起始点上游-1 349 bp至-329 bp的片段为靶序列,取长度不等的片段作为启动子与含氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因的质粒组成5个重组体,脂质体转染法转染上述重组体至人骨髓白血病细胞株:HL-60,CAT-ELISA测定细胞CAT表达水平以比较各重组体的启动子活性;同时加入细胞因子IL-10、IFN-γ、IL-4、重组人BAFF蛋白(rBAFF),以测定其对BAFF启动序列的影响。结果表明,-1 349^-329 bp、-1 349^-743 bp序列具有强启动调控活性,而-1 349^-1 099 bp片段启动活性最低。细胞因子IFN-γ、IL-10和rBAFF均能在一定程度上调人BAFF基因的启动活性,IL-4则一定程度地抑制BAFF基因的启动活性。研究提示,人BAFF基因-1349^-743 bp片段是进一步研究BAFF基因转录相关DNA结合蛋白的重要调控靶序列。细胞因子IL-10、IFN-γ、IL-4、rBAFF可以一定程度的在转录水平影响BAFF合成和分泌。

人B细胞激活因子受体-TACI基因表达水平的定量测定

目的:建立实时荧光定量PCR(RFQPCR)检测人B细胞激活因子受体TACImRNA含量的方法,初步探讨健康献血员外周血单个核细胞(PBMC)中TACImRNA表达水平。方法:在TACI基因高保守区设计特异性的引物和荧光探针,PCR扩增目的片段并实时检测产物的荧光强度,根据标准品建立的标准曲线,由软件自动计算出待测样本中TACImRNA准确含量,并以TACImRNA和β2MmRNA含量的比值作为评价TACI表达水平的指标。结果:本法检测TACImRNA含量的线性范围为109～101pg/ml,批内和批间重复性测定的CV分别为2.97%～9.32%和5.86%～10.29%。40例健康献血员样本的PBMC中35例(87.5%)检出有TACImRNA表达,范围为0.02～2.11。结论:成功建立RFQPCR检测TACImRNA含量的方法,具有较好的检测灵敏度和重复性,为进一步探讨TACImRNA表达水平与自身免疫性疾病发病机制之间的关系奠定了基础。