携带IL-24的溶瘤腺病毒作用于乳腺癌的体外实验研究

目的构建携带IL-24基因的溶瘤腺病毒CNHK600-IL-24,评估CNHK600-IL-24在体外对乳腺癌细胞的杀伤能力。方法将IL-24基因插入腺病毒穿梭载体SG502-ΔCR2,与5型腺病毒骨架载体pPE3共转染至人胚肾293细胞,获得溶瘤腺病毒CNHK600-IL-24。荧光显微镜观测及病毒体外增殖实验测评病毒在乳腺癌细胞MDA-MB-231和正常成纤维细胞MRC-5中的增殖情况;MTT法检测不同MOI值的病毒对两种细胞的抑制效应;ELISA法检测病毒感染细胞后上清液中IL-24的含量;Western blot法检测细胞内的IL-24蛋白;流式细胞检测细胞的凋亡情况。结果 CNHK600-IL-24经测序及PCR鉴定,病毒滴度为1.9×1010pfu/mL。CNHK600-IL-24感染MDA-MB-231细胞后表现出强大的增殖、复制能力,而在MRC-5细胞内增殖并不明显;CNHK600-IL-24在很低的浓度就能对MDA-MB-231细胞产生明显的杀伤效应,而对MRC-5细胞的杀伤作用明显减弱;CNHK600-IL-24感染MDA-MB-231细胞后,IL-24蛋白的表达明显增多,而感染MRC-5细胞后产生的IL-24维持在很低的水平。流式细胞检测发现,病毒引起的MDA-MB-231细胞明显凋亡而MRC-5细胞的凋亡率很低。结论本研究成功构建高滴度的溶瘤腺病毒CNHK600-IL-24,该病毒具有在乳腺癌细胞中特异性增殖并杀伤肿瘤细胞的能力。

RU486诱导调控载体的构建及体外表达

构建可经RU486诱导表达载体,并证实其对基因表达的调控作用。通过分子生物学技术,改造了含有GLP65反式作用调控因子和GAL4杂合启动子的PRS质粒。PCR扩增BGHpolyA片段,并引入需要的酶切位点。在GLP65调控区上游添加了hCMV启动子,在GAL4杂合启动子下游加入了荧光素酶报告基因。同时,为减少两个转录单元之间的潜在干扰,加入了1.2kb的小鸡β珠蛋白绝缘子。经PCR和限制性酶切及测序证实了载体的正确性。在体外转染HEK293细胞后,运用双荧光素酶报告基因技术鉴定了该系统的调控能力。加入诱导剂RU486后,可以诱导表达荧光素酶,并在一定范围内两者呈正比,最高可以实现荧光素酶的40余倍的表达,而没有RU486时,几乎没有报告基因的表达,表明RU486诱导调控载体构建成功,可实现对目的基因的表达时间和表达水平的精确调控,为进一步的基因调控研究和基因治疗提供了良好的工具。

可调控的鼠白细胞介素-12双亚基共表达质粒的构建及在体外表达

目的构建可经米非司酮(RU486)调控表达小鼠白细胞介素-12(mIL-12)单链融合基因的真核载体,并鉴定其调控表达效果。方法以GCp35Ep40PN质粒为模板,分别获取mIL-12p40和p35亚基的基因,重叠PCR引入linker后,克隆入pCA14质粒,测序正确之后,装入可调控载体pRS-17而构建成真核表达质粒pRS-RUmIL-12。用Lipofectamine2000将pRS-RUmIL-12质粒转染HEK293细胞,以不同剂量的RU486诱导其表达,然后用ELISA法检测其培养上清液中mIL-12蛋白的含量。结果所得mIL-12单链融合基因序列与设计一致。pRS-RUmIL-12在体外转染HEK293细胞后,ELISA检测结果表明该系统具有良好的调控能力:无诱导剂RU486时,mIL-12蛋白表达量很低,而加入诱导剂RU486后,可以诱导mIL-12的表达,并在一定范围内mIL-12的蛋白表达量与诱导剂的浓度呈正相关。结论成功构建了可经RU486调控的mIL-12双亚基共表达的真核表达质粒,可用于进一步的基因调控和基因治疗研究。

携带IL-24的溶瘤腺病毒对裸鼠乳腺癌移植瘤的抑制作用

目的构建携带IL-24基因的溶瘤腺病毒CNHK600-IL24，评估该病毒在裸鼠体内对乳腺癌的抑瘤能力。方法将IL-24基因插入腺病毒穿梭载体SG502-△CR2，与5型腺病毒骨架载体pPE3共转染至293细胞，获得溶瘤腺病毒CNHK600-IL24。建立乳腺癌原位成瘤模型、尾静脉注射及左心室注射模拟转移瘤模型，通过尾静脉注射CNHK600-IL24，应用“活体内光学成像系统”动态地观察病毒的疗效。结果CNHK600-IL24经测序及PCR鉴定正确，滴度为1．9×10＾10pfu／ml。乳腺癌原位成瘤模型：对照组的光子数以及肿瘤体积均明显高于CNHK600-IL24各治疗组（P〈0．05）。CNHK600-IL24治疗后肿瘤组织出现明显的坏死，肿瘤细胞发生显著的凋亡，免疫组化检测可见肿瘤细胞内Hexon和IL-24的表达。尾静脉注射模拟转移瘤模型：对照组的裸鼠大部分于38d前死亡，而CNHK600-IL24组的生存天数明显延长（P〈0．05）。左心室注射模拟转移瘤模型：活体内光学成像可见对照组与治疗组之间具有明显差别。结论高滴度的溶瘤腺病毒CNHK600．1124对于乳腺癌具有明显的抑瘤效果。

化疗对CD133＋结肠癌细胞的作用效果

目的观察化疗前后结肠癌细胞株HT29、SW620中CD133^＋结肠癌细胞的数量变化，探讨化疗对CD133^＋结肠癌细胞的作用效果。方法取对数生长的结肠癌细胞株HT29、SW620，采用80mg／L5-氟尿嘧啶（5．Fu）和25mg／L奥沙利铂（Oxaliplatin）分别作用8h，并设对照组，利用CD133抗体进行标记后再用流式细胞仪进行检测，观察化疗前后CD133^＋细胞的比例。结果流式细胞仪检测结肠癌细胞株HT29，80mg／L5-Fu处理8h组中CD133^＋肿瘤细胞为45．00％，与未处理组（32．80％）比较结果差异有统计学意义（P〈0．01）；25mg／L奥沙利铂处理8h组中CD133^＋肿瘤细胞为55．30％，与未处理组和80mg／L5-Fu处理8h组比较结果差异有统计学意义（P〈0．01）。流式细胞仪检测结肠癌细胞株SW620，80mg／L5-Fu处理8h组中CD133^＋肿瘤细胞为47．10％，与未处理组（33．90％）比较结果差异有统计学意义（P〈0．01）；25mg／L奥沙利铂处理8h组中CD133。肿瘤细胞为56．50％，与未处理组和80mg／L5-Fu处理8h组比较结果差异有统计学意义（P〈0．01）。结论CD133^＋结肠癌细胞能明显抵抗化疗。