暴发性肝衰竭中Toll样受体2表达的实验研究

目的 分析D-氨基半乳糖(D-Gal)/脂多糖(LPS)诱导的暴发性肝衰竭模型中肝组织Toll样受体2(TLR2)的表达变化及与细胞因子白细胞介素-18(IL-18)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、γ干扰素(IFN-γ)表达的关系,探讨TLR2在启动炎性应答而致肝损伤中的作用。 方法 BALB/C小鼠腹内联合注射D-Gal 900 mg/kg与LPS 10μg/kg后观察其存活率,并检测不同时间点血清转氨酶和血浆IL-18、TNF-α和IFN-γ含量。用半定量逆转录-聚合酶链反应和Tanon Gis2.0软件分析各时间点肝组织中TLR2 mRNA表达,并与血浆IL-18、TNF-α、IFN-γ含量进行相关分析;免疫组织化学观察肝组织TLR2蛋白的表达。 结果 给药后4 h,血清转氨酶明显升高(与0 h比较,P<0.05);10 h小鼠死亡率达80％。血浆IL-1 8、TNF一α和IFN-γ含量逐步上升,IL-18在1 h即显著升高,之后持续高表达;TNF-α在2 h、5 h有两个分泌高峰;IFN-γ在2 h前增加不明显(F=2.5 7,P=0.1 3),但3 h及以后则显著升高(与0 h比较,P<0.01)。正常小鼠肝组织少量表达TLR2 mRNA,给药后1 h表达即显著增强(与0 h比较,P<0.05);免疫组织化学也显示TLR2蛋白有类似的变化,尤其肝窦内皮细胞、库普弗细胞表达更为显著;且部分肝细胞凋亡、坏死后,残存肝组织仍有较高TLR2表达。相关分析表明,肝组织TLR2

牛磺酸熊脱氧胆酸对细胞色素C介导HepG2细胞凋亡的作用

目的 探讨牛磺酸熊脱氧胆酸(TUDCA)对牛磺酸脱氧胆酸(TDCA)诱导HepG2细胞凋亡阻抑作用及分子机制。 方法 应用Hoechst 3325 8染色、电镜和DNA电泳对细胞凋亡进行定性;应用流式细胞仪对凋亡细胞进行定量;检测TDCA单独孵育及与TUDCA共孵育时,胞浆中细胞色素C含量及Caspase-3、8、9蛋白酶活性的变化。 结果 TDCA 400μmol/L孵育12 h可诱导显著HepG2细胞凋亡,凋亡率为(50.35±2.20)％,细胞经TUDCA与TDCA共孵育后,细胞凋亡率明显下降,为(13.78±0.84)％;TUDCA能显著抑制TDCA引起的细胞色素C释放及Caspase-9、3蛋白酶活性升高,孵育12 h时,Caspase-3活性分别下降54.9％(t=16.88,P<0.01)和52.5％(t≥13.00,P<0.01),轻度降低Caspase-8活性升高,活性下降24.5％(t=1.94,P>0.05)。结论 稳定线粒体膜、阻止细胞色素C释放及随后Caspase-9、Caspase-3活化,是TUDCA抗凋亡的主要机制。抗凋亡作用可能是TUDCA治疗胆汁淤积性肝病取得显著疗效的重要机制之一。

抗半胱氨酸蛋白酶-7核酶的克隆、体外表达与切割活性的研究

目的 设计并合成抗小鼠半胱氨酸蛋白酶-7(caspase-7)的锤头状核酶,并对它们的体外表达与体外切割活性进行研究。 方法 采用计算机软件对锤头状核酶和小鼠caspase-7基因的二级结构进行分析,核酶的DNA序列在体外由自动合成仪合成,小鼠caspase-7目的基因通过RT-PCR扩增获得,将核酶基因和caspase-7基因分别克隆入载体pBSKneoU6’和pGEM-T中,通过体外转录得到核酶和caspase-7mRNA,通过体外切割筛选出具有切割活性的核酶。 结果 针对目的基因的333和394位点发计合成了两个核酶:Rz333和Rz394。成功获得caspase-7 mRNA的表达载体pC7及含有核酶的重组质粒pU6Rz333和pU6Rz394,通过体外转录表达出含有caspase-7 mRNA的987 nt的靶mRNA及完整的核酶Rz333(47 nt)和Rz394(50 nt)。体外切割实验证实Rz333能够定点切割caspase-7 mRNA,产生243 nt和744 nt的切割产物,切割效率为67.98％。Rz394不能切割靶基因。 结论 核酶Rz333能够位点特异性的切割caspase-7 mRNA。