增强型绿色荧光蛋白与MAGE-n共表达载体的构建及表达

目的构建增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP)与人黑色素瘤抗原-n(melanomaantigenn,MAGE-n)真核共表达载体,并在小鼠黑色素瘤B16细胞中进行表达。方法采用酶切法从pLXSN-MAGE-n中得到MAGE-n基因片段,克隆至真核表达载体pIRES2-EGFP中,构建真核共表达质粒pIRES2-EGFP-MAGE-n。用脂质体法转染小鼠黑色素瘤B16细胞,G418筛选阳性克隆,荧光显微镜检测阳性克隆中EGFP的表达,RT-PCR、Westernblot和免疫组化分别检测阳性克隆中MAGE-nmRNA和蛋白的表达水平。结果从pLXSN-MAGE-n重组质粒中酶切获得一条约950bp的片段,成功构建了真核共表达载体pIRES2-EGFP-MAGE-n,转染B16细胞后筛选得到阳性克隆,可见到EGFP的表达,产生明亮的绿色荧光,RT-PCR检测到MAGE-nmRNA的表达,Westernblot和免疫组化检测到MAGE-n蛋白的表达。结论成功构建了共表达质粒pIRES2-EGFP-MAGE-n,获得了稳定共表达EGFP和MAGE-n的小鼠黑色素瘤B16细胞系,为进一步研究MAGE-n在肿瘤免疫治疗中的作用奠定了基础。