维护牙周健康的中国口腔医学多学科专家共识(第一版)

牙周病是导致成年人牙齿丧失的主要原因,也是影响口腔和全身健康的主要因素之一。在口腔疾病诊治过程中,多个口腔医学的亚专业涉及牙周组织健康的维护问题。中华口腔医学会组织多个相关专业的专家,经过反复研讨,撰写了本专家共识,旨在增强口腔医学专业工作者维护牙周组织健康的意识,规范口腔诊疗行为。若能尽早发现和判定是否存在牙周病损及其损害程度,并进行适度干预,科学地判断修复、正畸、种植、牙体牙髓等诊疗活动的预后,则可提高口腔疾病的防治水平。

脂多糖诱导的内质网应激在牙周膜干细胞中的表达及其对成骨分化的影响

目的 探讨使用脂多糖模拟炎症微环境下牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells,PDLSC）中内质网应激（endoplasmic reticulum stress,ERS）的表达差异及对成骨分化的影响,初步证明ERS可以调控炎症微环境下的PDLSC,使其与正常来源的PDLSC相比成骨分化能力产生差异.方法 原代和有限稀释法克隆化培养正常来源的PDLSC,使用ERS激动剂毒胡萝卜素（thapsigargin,TG）观察是否可以诱导PDLSC发生ERS;实时定量PCR检测使用炎性因子脂多糖刺激是否可以诱导PDLSC发生ERS;使用含有成骨诱导培养基的TG和ERS抑制剂4-苯基丁酸（4-phenylbutyrate,4-PBA）刺激PDLSC,实验组分为PDLSC＋ TG组、PDLSC＋脂多糖组及PDLSC＋脂多糖＋4-PBA组,对照组为单纯成骨诱导培养基诱导的PDLSC组,实时定量PCR、茜素红染色及氯化十六烷基吡啶检测其成骨分化能力的差异.结果 炎性因子体外模拟炎症环境可观察到ERS被激活,PDLSC＋TG组6h时PERK、GRP78、ATF4及CHOP mRNA表达量均显著高于PDLSC组（分别为1.49±0.24、2.77±0.60、1.75±0.16、2.16±0.32）,P＜0.05;PDLSC＋脂多糖组PERK、CHOP mRNA表达量均在6h时达峰值（分别为1.76±0.08、2.31±0.17）,且与PDLSC组相比差异均有统计学意义（P＜0.05）.模拟牙周炎症微环境下的ERS状态可抑制PDLSC的成骨分化,PCR结果显示PDLSC＋ TG组RUNX2、ALP、OCN mRNA表达量为0.73±0.06、0.01 ±0.00、0.20±0.06,均显著低于PDLSC组（P＜0.05）;PDLSC＋脂多糖组RUNX2、ALP、OCN mRNA表达量分别为0.80±0.06、0.48±0.05、0.29±0.04,均显著低于PDLSC组（P＜0.05）;PDLSC＋脂多糖＋4-PBA组RUNX2、ALP、OCN mRNA表达量分别为1.10±0.09、0.74±0.05、0.67±0.13,均显著高于PDLSC＋脂多糖组（P＜0.05）.茜素红染色及氯化十六烷基吡啶定量结果和PCR结果相符.结论 体外使用脂多糖模拟炎症微环境,可具有同ERS激活剂TG相同的作用,刺激PDLSC,使其ERS被激活,进而成骨分化受到抑制;加入ERS抑制剂4-PBA后可使脂多糖抑制成骨分化的作用得到恢复.

炎性牙周膜干细胞通过调控巨噬细胞内质网应激介导白介素-1β分泌的研究

目的探讨炎性牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cell,PDLSC)对巨噬细胞分泌白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)的影响及其机制。方法使用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激PDLSC模拟炎性环境。收集健康PDLSC培养基和模拟炎性环境条件PDLSC培养基,分别作用于人单核细胞系THP-1细胞,以此分为健康PDLSC条件培养基(conditioned medium of health PDLSC,CM-H)组和炎性PDLSC条件培养基(conditioned medium of LPS-PDLSC,CM-LPS)组。条件培养24 h后,弃条件培养基,正常培养THP-1细胞24 h。酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法检测THP-1细胞上清液中IL-1β的表达量,实时荧光定量PCR检测THP-1细胞内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)相关基因葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78)、活化转录因子6(activating transcription factor-6,ATF6)、需肌醇酶1(inositol requiring enzyme 1,IRE1)、蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)、CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT enhancer binding protein homologous protein,CHOP)、活化转录因子4(activating transcription factor-4,ATF4)、剪切型X-盒结合蛋白1(X box binding protein 1 spliced,XBP1s)的表达,蛋白质印迹法检测GRP78、CHOP蛋白表达。使用ERS抑制剂4-苯基丁酸(4-phenylbutyrate,4-PBA)预处理THP-1细胞进行干预实验,以不同浓度进行分组,包括0(对照组)、1、10和20 mmol/L组,检测ERS相关基因mRNA表达和IL-1β分泌的变化。结果ELISA结果显示,CM-LPS组THP-1细胞IL-1β表达量[(31.35±2.11)ng/L]显著高于CM-H组[(8.19±1.51)ng/L](t=12.60,P<0.01)。实时荧光定量PCR结果显示,与CM-H组相比,CM-LPS组GRP78、ATF6、IRE1、PERK、CHOP、ATF4、XBP1s表达(分别为1.782±0.070、1.387±0.204、1.404±0.119、1.777±0.187、1.325±0.156、1.295±0.066、1.137±0.149)均显著升高(P<0.05)。4-PBA干预实验中,1、10、20 mmol/L组中GRP78、IRE1、ATF6、PERK、CHOP的表达均显著低于对照组(P<0.05)。与对照组[(31.23±1.98)ng/L]相比,10和20 mmol/L组THP-1细胞IL-1β分泌水平[分别为(21.20±0.37)、(23.85±1.80)ng/L]均显著下降(P<0.05)。结论炎性PDLSC可以通过上调巨噬细胞的ERS促进巨噬细胞分泌IL-1β。

牙龈上皮屏障及其在牙周炎发生与发展中的作用

牙周炎是人类口腔中最常见的疾病之一.研究表明,全球范围内成年人牙周炎的患病率超过50％[1].目前普遍认为,牙周炎是由龈下菌斑微生物和宿主防御相互作用导致的一种以牙槽骨破坏、牙齿脱落为主要表现的口腔炎症性疾病.牙龈上皮作为微生物攻击牙周组织的首道屏障,在牙周炎的发生、发展过程中扮演重要角色.下面将从牙龈上皮的物理屏障、化学屏障及免疫屏障作用等几个方面概述牙龈上皮的功能及其在牙周炎发生、发展中的作用.

细胞外调节蛋白激酶信号通路调控牙周膜干细胞内皮分化的机制研究

目的 探讨细胞外调节蛋白激酶（extracellular signal-regulated kinase,ERK）通路在牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells,PDLSC）内皮向分化中的作用,为PDLSC分化调控提供实验基础.方法 使用血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）和碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,b-FGF）联合诱导PDLSC向内皮细胞分化（诱导组）,对诱导分化的细胞使用ERK1/2磷酸化阻断剂U0126进行处理（诱导＋U0126组）,同时用二甲基亚砜（dimethylsulfoxide,DMSO）作为对照（诱导＋DMSO组）,空白对照组为未经诱导的PDLSC;蛋白质印迹法检测诱导组0、1、3、6及12h的胞内磷酸化ERK1/2 （p-ERK1/2）表达水平;各组诱导7d后提取细胞RNA,实时荧光定量PCR法检测细胞内CD31、血管内皮钙黏素（vascular endothelial-cadherin,VE-cadherin）和VEGF mRNA的表达情况;各组诱导14d,流式细胞计数法检测CD31＋和VE-cadherin＋细胞比例,基质胶管腔形成实验检测细胞的管腔形成能力.计量资料采用均值±标准差表示,两组间比较采用独立样本t检验;多组间比较采用单因素方差分析.结果 诱导1、3h后p-ERK1/2与ERK1/2比值分别升高至1.24±0.12、1.03±0.24,均显著高于诱导前（0.58±0.17）（P＜0.01）;实时荧光定量PCR结果显示,诱导＋U0126组CD31、VEGF mRNA相对表达水平分别降至0.09±0.18、0.49±0.17,均显著低于诱导组细胞（P＜0.05）;流式细胞检测结果显示,诱导＋U0126组CD31＋、VE-cadherin＋细胞比值分别降至5.22±0.85、3.56±0.87,均显著低于诱导组细胞（P＜0.05）;基质胶管腔形成实验显示诱导组的分支节点数、管腔数目、管腔长度分别升高至62.3±10.0、145.0±14.8及（32 129.7±4 413.9）像素,而诱导＋U0126组分别下降至7.0±2.7、33.5±6.4及（15 951.0±758.1）像素,均显著低于诱导组（P＜0.05）.结论 PDLSC内皮分化过程受ERK通路正向调控,阻断ERK1/2磷酸化可以抑制PDLSC的内皮分化能力.

牙周膜单克隆细胞间成骨异质性及组蛋白乙酰转移酶影响细胞交流的研究

目的 探讨成骨分化能力存在差异的正常牙周膜单克隆细胞之间信息交流对单克隆细胞成骨分化能力的影响,以及组蛋白乙酰转移酶在其中的作用.方法 通过有限稀释法获取正常牙周膜来源的单克隆细胞,采用间接共培养法在6孔板铺有一定成骨能力的单克隆细胞,设置空白对照组、成骨弱组及成骨强组,分别对应Transwell小室不加细胞、加成骨能力弱和成骨能力强的细胞,每组设置3个复孔,间接共培养4 d后移除Transwell小室进行成骨诱导,实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,qPCR）及茜素红染色检测3组下层细胞成骨诱导后成骨能力的改变,蛋白质印迹法检测下层细胞组蛋白H3的乙酰化水平,qPCR比较组蛋白乙酰转移酶表达的改变.结果 流式细胞术检测结果显示牙周膜单克隆细胞阳性表达间充质干细胞表面标志物CD29、CD90、CD105和CD146,表达率分别为（99.80±0.02）%、（99.36±0.18）%、（99.41±0.05）%和（95.10±2.11）%;阴性表达CD31和CD34,表达率分别为（0.29±0.11）%和（0.22±0.13）%.茜素红及油红O染色显示单克隆细胞具有成骨成脂分化能力.碱性磷酸酶和茜素红染色结果显示同一个体牙周膜来源的不同单克隆细胞间存在成骨差异.间接共培养实验显示成骨强和弱的单克隆细胞成骨相关基因骨钙蛋白（分别为14.24±5.60、4.78±2.90）及Runt相关转录因子2（Runt-related transcription factor 2,RUNX2）mRNA表达量（分别为2.75±1.44、1.61±0.44）均显著高于空白对照组（骨钙蛋白与RUNX2分别为1.00±0.47和1.00±0.39）（P〈0.05）;成骨强组骨钙蛋白及RUNX2 mRNA相对表达量均显著高于成骨弱组（P〈0.05）.蛋白质印迹法结果显示,成骨强及成骨弱组组蛋白H3乙酰化水平[分别为（0.76±0.09）和（0.54±0.12）]均显著高于空白对照组（0.30±0.04）（P〈0.05）.qPCR结果显示组蛋白乙酰转移酶中KAT6A变化最显著,趋势与组蛋白H3的乙酰化水平趋势相同.结论 正常牙周膜来源的单克隆细胞间成骨分化能力存在差异,成骨能力强的单克隆细胞可能通过促进其他细胞KAT6A上调影响其组蛋白乙酰化水平,促进其成骨分化.

临床及影像学锥形束CT检测生物学宽度一致性的对比分析

目的比较使用锥形束CT和牙周探针测量生物学宽度的一致性,同时比较不同牙龈生物型的生物学宽度是否相同,为临床提供参考。方法经过纳入与排除标准筛选后,选取2017年11月至2018年6月在第四军医大学口腔医学院牙周病科拟行牙冠延长术的27例患者[13例男性,14例女性,年龄(37.6±13.7)岁]共40颗患牙(前牙14颗,后牙26颗),按通用标准分为薄龈生物型[5例男性,8例女性,年龄(40.2±15.0)岁,21颗患牙]和厚龈生物型[8例男性,6例女性,年龄(35.1±11.9)岁,19颗患牙]两组,40颗患牙术前均行锥形束CT检查,术中使用牙周探针测量所有受试牙的生物学宽度以及龈沟深度,对获得的数据进行统计学分析。结果两种方法测量40颗患牙的生物学宽度[牙周探针:(1.64±0.26)mm;锥形束CT:(1.69±0.20)mm]、21颗薄龈生物型患牙的生物学宽度[牙周探针:(1.49±0.19)mm;锥形束CT:(1.57±0.12)mm]及19颗厚龈生物型患牙的生物学宽度[牙周探针:(1.80±0.21)mm,锥形束CT:(1.87±0.18)mm]差异均无统计学意义(P>0.05);前牙与后牙的生物学宽度[前牙:(1.59±0.15)mm,后牙:(1.67±0.29)mm,P=0.42]以及龈沟深度[前牙:(2.00±0.28)mm,后牙:(2.11±0.43)mm,P=0.44]差异亦均无统计学意义。使用两种方法分别测量薄龈生物型与厚龈生物型组的生物学宽度,两组差异均有统计学意义(P<0.01)。使用牙周探针测量薄龈生物型组[(1.93±0.28)mm]与厚龈生物型组龈沟深度[(2.24±0.41)mm]差异有统计学意义(P<0.01)。结论使用锥形束CT测量的生物学宽度与使用牙周探针测得的数据一致;薄龈生物型与厚龈生物型的生物学宽度以及龈沟深度差异有统计学意义。