人涎腺上皮细胞体外培养及其生物学特性的初步研究

目的建立体外培养人涎腺上皮细胞的方法,观察其体外生长的生物学特性。方法应用组织块培养法,用无血清培养基(SFM),无血清1∶1DMEM/F12以及含25ml/L胎牛血清的1∶1DMEM/F123种不同的培养基对10例人涎腺标本进行体外原代和传代培养。用倒置显微镜观察培养细胞体外生长的形态特征。用细胞计数法观察细胞生长情况。用HE染色、PAS染色、细胞角蛋白、Vimentin免疫组化染色对培养细胞进行形态学检查和鉴定。结果10例人涎腺标本在体外原代培养均有细胞长出,培养的细胞为上皮样。用SFM培养的细胞增殖较旺盛,可传代培养5次,用其它2种培养基培养的细胞仅可传代1次。细胞角蛋白染色阳性,Vi-mentin染色阴性,PAS染色阳性。结论应用组织块培养的方法可以获得原代和传代培养的人涎腺上皮细胞,SFM较1∶1DMEM/F12更适宜涎腺上皮细胞生长。

人黏液表皮样癌裸鼠耐药移植瘤模型的建立及其生物学特性

目的:建立一种耐药性稳定的人涎腺黏液表皮样癌裸鼠移植瘤模型。方法:将人涎腺黏液表皮样癌多药耐药细胞接种于裸鼠皮下,成瘤后经腹腔注射小剂量5-FU进行体内诱导,建立稳定的黏液表皮样癌裸鼠移植瘤模型。结果:裸鼠移植瘤原代培养的MEC/5-FU/NU细胞与体外培养细胞结构类似,MEC/5-FU/NU细胞对5-FU的耐药指数为27.82。RT-PCR显示耐药相关基因ABCB1、ABCB11、GSTA1在MEC/5-FU/NU细胞中明显高表达(P<0.05)。免疫荧光显示多药耐药蛋白MDR-1在MEC/5-FU/NU细胞中高表达。结论:以MEC/5-FU建立的黏液表皮样癌裸鼠皮下移植瘤模型仍保持MEC/5-FU细胞的形态学特征和多药耐药性,可为耐药性人涎腺黏液表皮样癌耐药机制和逆转的研究提供较理想的动物模型。

PTEN抑癌基因对高转移性黏液表皮样癌细胞系生物学行为的影响

目的 探讨外源野生型PTEN抑癌基因对人高转移性黏液表皮样癌细胞系M3SP2体外黏附、迁移和侵袭特性的影响。方法 用脂质体介导方法将PTEN抑癌基因导入M3SP2细胞系 (M3SP2 -PTEN细胞 ) ,转染空载体的细胞系作为对照(M3SP2 -pBp细胞 ) ,分别用四甲基偶氮唑蓝 (MTT)比色法、细胞迁移试验及细胞侵袭试验测定M3SP2 -PTEN细胞和M3SP2 -pBp细胞体外黏附、迁移和侵袭能力。结果 M3SP2 -PTEN细胞在Metrigel和Fn基质上黏附数量减少 ,与对照组比较差异有显著性 (P <0 0 1) ,黏附抑制率分别为 34 3%和 4 9 4 %。M3SP2 -PTEN细胞在Matrigel基质上迁移距离小 ,与对照组比较差异有显著性 (P <0 0 5 ) ,迁移抑制率为 2 6 0 %。M3SP2 -PTEN细胞体外侵袭细胞数量减少 ,与对照组比较差异有显著性 (P <0 0 1) ,侵袭抑制率为 31 4 %。结论 外源性PTEN抑癌基因对高转移性黏液表皮样癌细胞系M3SP2体外黏附、迁移和侵袭具有抑制作用。

阻断氯离子通道对小鼠成牙本质细胞MDPC-23生物学特性影响的研究

目的:研究氯离子通道对小鼠成牙本质细胞MDPC-23生物学特性的影响。方法:应用MTT、生化分析、荧光染色等方法,观察NPPB阻断氯离子通道之后MDPC-23细胞增殖,ALP活性以及形成细胞外矿化基质的能力等方面的变化。结果:氯离子通道被阻断后,细胞的增殖速度减慢,培养上清中的碱性磷酸酶活性明显增高,而且细胞外矿化结节的形成时间比对照组缩短。结论:阻断氯离子通道可抑制成牙本质细胞MDPC-23的增殖,但对其矿化有一定的促进作用。

口腔颌面部恶性肿瘤患者全唾液中 TNF-α 含量的放射免疫分析

采用放射免疫法（ＲＩＡ）检测正常人和口腔颌面部恶性肿瘤患者全唾液和血清中ＴＮＦ－α的含量，同时观察５例口腔颌面部恶性肿瘤患者手术前、后全唾液中ＴＮＦ－α水平变化。结果可见：①全唾液中ＴＮＦ－α含量正常组为１２．６１±５．３０ｆｍｏｌ／ｍｌ；肿瘤组为１２．７６±８．６２ｆｍｏｌ／ｍｌ，两者无显著性差异；②肿瘤组血清中ＴＮＦ－α含量为２１．６４±３．２６ｆｍｏｌ／ｍｌ，全唾液中ＴＮＦ－α含量为１２．２２±４．６２ｆｍｏｌ／ｍｌ，两者相比有显著性差异（Ｐ＜０．０００４）。③５例手术前全唾液中ＴＮＦ－α含量为１２．７６±８．６２ｆｍｏｌ／ｍｌ，手术后为１１．９±１０．５７ｆｍｏｌ／ｍｌ。从有限例数的结果提示尚不宜采用唾液检测来代替血清检测。

雌二醇治疗更年期综合征引起腺样囊性癌细胞增殖的研究

目的:探讨17-β雌二醇(E2)对人腺样囊性癌细胞SAcc83增殖的影响。方法:采用细胞计数法描绘细胞生长曲线,细胞计数法测定细胞分裂指数,软琼脂克隆形成实验检测细胞克隆形成率,利用流式细胞仪进行细胞周期分析。结果:1×10-7,1×10-8,1×10-9mol/L的E2对Sacc83均有促增殖作用,其中1×10-7mol/L的E2作用最显著,使SAcc83细胞群体倍增时间缩短了17.2%,克隆形成率增加了39.0%(P<0.01,t=7.945)作用1,2,3d时细胞分裂指数分别增加了33.3%,40.9%,17.8%,作用12,18,24h时S期细胞分别增加了12.3%,3.3%和9.7%。结论:E2对人腺样囊性癌细胞有促进增殖的作用,临床应用雌激素时应该慎重。

转化生长因子-β1 shRNA真核表达载体的构建

目的构建转化生长因子β1(TGF-β1)的短发夹状RNA(shRNA)表达系统,为人涎腺粘液表皮样癌的治疗提供新的方法。方法根据Genebank提供的TGF-β1 mRNA序列,设计短链寡核苷酸,化学合成后经退火形成双链 DNA片段,克隆到pWH1载体中,用酶切方法对重组体进行鉴定:最后将构建的TGF-β1特异性shRNA表达载体转染涎腺粘液表皮样癌细胞,通过RT-PCR、免疫组化观察其对细胞TGF-β1 mRNA和蛋白水平表达的影响。结果经酶切、连接后构建的质粒称之为pWH1-TGF-β1。酶切证实成功构建了TGF-β1 shRNA表达载体,RT-PCR和免疫组化结果显示其能够在mRNA和蛋白水平抑制细胞内TGF-β1的表达。结论成功构建的TGF-β1特异性shRNA表达载体具有阻断TGF-β1表达的功能,可能为涎腺粘液表皮样癌治疗提供有效的方法和手段。

永生化下颌骨髁突软骨细胞的微囊化研究

为了探讨微囊包裹软骨细胞在软骨组织工程中的适用性 ,根据气流切割原理采用海藻酸钠 -多聚赖氨酸 -海藻酸钠 ( APA)对永生化下颌骨髁突软骨细胞 ( Im mortalized mandibular condylar chondrocyte,IMCC)进行微囊包裹。用倒置显微镜观察、台盼蓝染色、细胞记数、HE染色、免疫组化等方法检测微囊的大小、细胞的生长及微囊内组织的软骨特性等情况。研究发现 ,IMCC可在微囊内存活 ,活细胞率 >80 % ,微囊直径平均 779μm。细胞数量随着培养时间的延长逐渐增多 ,约 2 0 d左右达到平台期 ,细胞在囊内呈簇样生长 ,高表达软骨特异的蛋白多糖和 型胶原。提示 IMCC可在微囊内形成类软骨组织样结构 。

基因表达谱芯片技术筛选涎腺腺样囊性癌转移相关基因

目的:应用基因芯片技术对口腔涎腺腺样囊性癌细胞系ACC-2及其肺高转移细胞株ACC-M的基因表达谱进行对比分析。筛选差异表达基因,以期从基因水平上探讨肿瘤转移机制。方法:以涎腺腺样囊性癌细胞系ACC-2及其肺高转移细胞株ACC-M作为研究肿瘤转移分子机制的模型。提取mRNA,逆转录为cDNA,用Cy3和Cy5荧光染料标记,制备成cDNA探针,与表达谱芯片进行杂交扫描和分析;并应用RT-PCR技术对其中7个基因进行验证。结果:在1152个基因表达谱的筛选中,26个基因表达差异(2倍以上),其中19个基因表达水平上调,7个基因表达水平下调。RT-PCR技术对其中7个基因表达差异的验证结果与基因芯片结果一致。结论:基因芯片筛选发现其中2.3%的基因可能与涎腺腺样囊性癌细胞转移侵袭相关。

TGF-β1 shRNA对人涎腺粘液表皮样癌Ms细胞增殖的影响

目的:用TGF-β1shRNA稳定转染涎腺粘液表皮样癌Ms细胞,观察shRNA的基因沉默效应及其对细胞增殖的影响。方法:用Liperfetamine2000将TGF-β1shRNA转染Ms细胞,以G418(600mg/L)筛选21d,挑出单克隆获得稳定转染细胞系。RT-PCR法和免疫组化方法检测细胞中TGF-β1mRNA和蛋白的表达。利用MTT、软琼脂克隆形成实验、流式细胞仪、透射电镜等检测转染前后Ms细胞的增殖和形态特点,以空载体转染和未转染细胞为对照。结果:获得稳定转染TGF-β1shRNA的细胞系。TGF-β1shRNA阻断了Ms细胞中TGF-β1mRNA和蛋白的表达。未转染组,转染空载体组和转染shRNA组,细胞倍增时间分别为39.3h,40.1h和45.3h,Gl期细胞所占比例分别为54.2%,56.8%和61.7%,增殖指数PI分别为0.46,0.43和0.38;软琼脂克隆形成率分别为34.7%,33.3%和15.8%;超微结构观察见转染细胞细胞器扩张和肿胀,核浆比例变小,核仁减小,数目减少,核分裂像减少。结论:应用shRNA沉默TGF-β1基因可抑制Ms细胞的增殖。

小鼠重组Periostin对人牙周膜细胞粘附、伸展和移动的影响

目的 :研究小鼠重组Periostin对人牙周膜细胞 (PDL细胞 )粘附、伸展及移动的影响。方法 :采用固相结合分析以及细胞机械创伤模型等细胞学方法 ,观察PDL细胞在Periostin基质上的粘附率、伸展率及其定向移动的能力。结果 :Periostin可促进PDL细胞的粘附、伸展和移动 ,当浓度在 40mg/L时 ,作用最为显著 (P <0 .0 1) ,与纤维结合蛋白 (FN)的作用相似。结论 :小鼠重组Periostin可有效促进PDL细胞的附着、伸展及移动 ,但其作用的确切分子机制还需深入研究。

人胎儿骨髓基质干细胞的分离、体外培养和鉴定

目的 分离培养并鉴定人胚胎骨髓基质干细胞。方法 抽取流产胎儿股骨骨髓 ,Percoll离心纯化分离 ,取界面有核细胞培养。不同培养基培养对比 ,观察细胞生长曲线 ,免疫细胞化学鉴定细胞膜表面分子。结果 得到纯化率较高的骨髓基质干细胞 (MSCs) ,用αMED比DMEM和RPMI16 4 0原代培养生长速度快 ,第二代MSCs在上述三种培养基中倍增时间分别为 4 3h、5 4h、5 6h。免疫细胞化学结果 99%CD4 4 ( + )、98%Vim( + )、所有细胞CD34( - )、CD2 9( - )。结论 Percoll离心法成功地分离纯度较高的MSCs。MSCs在αMEM中培养增殖率比在DMEM和M 16 4

基质金属蛋白酶-1在人涎腺腺样囊性癌细胞中的表达

目的:测定基质金属蛋白酶-1(MMP-1)在人涎腺腺样囊性癌不同转移力细胞系中的表达。方法:以人涎腺腺样囊性癌ACC-2细胞系及其高转移株ACC-M作为研究肿瘤转移分子机制的模型,采用免疫组化法和蛋白印迹(Western blot)法检测MMP-1的蛋白表达水平。结果:MMP-1在ACC-M细胞中的表达水平高于ACC-2细胞。结论:MMP-1在人涎腺腺样囊性癌的侵袭转移过程中可能发挥作用。

基因表达谱芯片技术筛选舌癌转移相关基因

目的应用基因表达谱芯片技术对口腔舌癌细胞系Tca8113及其脑转移细胞株Tb的基因表达谱进行对比分析并筛选差异表达基因,以期从基因水平上探讨舌癌转移机制。方法以舌癌细胞系Tca8113及其脑转移细胞株Tb作为研究肿瘤转移分子机制的模型,提取mRNA,逆转录为cDNA,用Cy3和Cy5荧光染料标记,制备成cDNA 探针,与基因表达谱芯片进行杂交扫描和分析;并应用RT-PCR技术对其中6个基因进行验证。结果在1152个基因表达谱的筛选中,37个基因表达有差异(2倍以上),其中15个基因表达水平上调,22个基因表达水平下调。 RT-PCR技术对其中6个基因表达差异的验证结果与基因芯片结果一致。结论舌癌细胞转移侵袭可能与多个基因相关。

牙本质涎磷蛋白在小鼠牙胚表达的原位杂交研究

目的 :探讨牙本质涎磷蛋白 (dentinsialophosphoprotein ,DSPP)mRNA在牙齿发育过程中的作用。方法 :采用原位杂交技术 ,观测小鼠牙齿发育各阶段标本中DSPPmRNA的表达。结果 :DSPP在成牙本质细胞的表达始于钟状中期 ,并贯穿以后的各个时期 ;此阶段 ,它还在前成釉细胞及成釉细胞中具有一过性表达。结论 :DSPP在牙胚发育过程中的表达具有时空特异性 ;

RPMI1640,DMEM及不同生长因子对大鼠颌下腺细胞生长作用的观察

目的 观察RPMI 16 4 0、DMEM及不同生长因子对大鼠颌下腺细胞增殖能力的影响 ,探讨最有利于大鼠颌下腺细胞的培养方法。方法 在RPMI 16 4 0或DMEM培养基中分别加入一定浓度的FBS(胎牛血清 )、EGF(表皮生长因子 )、HC(氢化可地松 )、INS(胰岛素 ) ,观察纤维细胞和腺细胞在不同培养基中的增殖能力。结果 在含5 %FBS、10ng/mlEGF、5 μg/mlHC、5 μg/mlINS的DMEM培养基中 ,上皮细胞生长良好 ,在只含血清的RPMI 16 4 0培养基中 ,纤维细胞生长旺盛 ,上皮样细胞生长不良 ,在不含血清的培养基中所有细胞均生长缓慢。结论 含有 5 %血清、10ng/mlEGF、5 μg/mlHC及 5

HL-60细胞及其耐药细胞株HL-60/ADM超弱发光的检测

目的:探讨人急性早幼粒白血病细胞系(HL-60)和其耐药株抗阿霉素人急性早幼粒白血病细胞系(HL-60/ADM)的超弱发光与耐药性的关系。方法:应用MTT比色法、流式细胞术、细胞生长曲线和免疫组化染色法,检测HL-60细胞、HL-60/ADM细胞对阿霉素(ADM)的敏感性、细胞周期变化及P-糖蛋白(P-gp170)的表达。用IFFM-D型流动式化学发光仪检测HL-60细胞及HL-60/ADM细胞的超弱发光强度。结果:HL-60/ADM细胞对ADM的敏感性明显低于亲本HL-60细胞;HL-60/ADM细胞中G0/G1期的细胞为44·80%±1·97%,G2/M期的细胞为9·90%±0·27%,较其亲本细胞增多,S期的细胞为45·30%±1·93%,较其亲本细胞减少(P<0·05);HL-60/ADM细胞倍增时间是HL-60细胞的1·8倍,P-gp170的表达呈阳性,HL-60细胞呈阴性。在1×10-4mol/L鲁米诺及3mL/L双氧水条件下,密度分别为8×107/L、1×108/L、1·26×108/L及2·73×108/L的HL-60/ADM细胞超弱发光强度低于HL-60细胞(P<0·05)。结论:HL-60/ADM细胞对ADM的敏感性降低,细胞生长延缓,P-gp170表达呈阳性等均提示HL-60/ADM细胞出现了耐药性;且随着HL-60/ADM细胞耐药性的产生其超弱发光强度较其亲本细胞HL-60降低,提示细胞超弱发光强度明显降低可作为细胞耐药性产生的一项指标。

雌激素受体在人舌癌细胞系中的表达

目的:测定雌激素受体(ER)在人舌癌细胞系Tca8113以及高转移株Tb上的表达。方法:用免疫细胞化学方法和RT-PCR方法检测雌激素受体在人舌癌细胞上的表达,并对其表达量进行相对定量分析。结果:经免疫细胞化学和RT-PCR方法可检测到ER在人舌癌细胞上有表达。ERα在Tb细胞系的表达强于Tca8113;而ERβ的表达在Tca8113和Tb中相同,并且ERα/ERβ比值在脑转移株Tb中升高。结论:雌激素有可能通过它的受体对人舌鳞癌细胞产生一定的影响。ERα/ERβ比值的改变在舌癌发生和转移过程中可能起一定作用。

可溶性肿瘤坏死因子受体对炎性牙周膜细胞的作用

目的:分析可溶性肿瘤坏死因子受体及T淋巴细胞对炎性牙周膜细胞的作用。方法:实验于2005-03/09在解放军第四军医大学口腔医学院口内实验室完成。免疫磁珠分离CD3+T淋巴细胞于解放军第四军医大学唐都医院骨科实验室完成。CD3+T淋巴细胞取自正常人的外周血,牙周膜成纤维细胞和淋巴细胞培养液均购自美国Gbico公司,大肠杆菌内毒素购自Sigma公司,质粒引物合成及目的基因检测均于Takara公司完成。正常牙周膜成纤维细胞与CD3+T淋巴细胞共培养,加入大肠杆菌内毒素,实验组用PcDNA3.1(+)-可溶性肿瘤坏死因子受体转染细胞的培养液培养,对照组用转染空质粒的细胞培养液培养。空白组为正常牙周膜成纤维细胞加CD3+T淋巴细胞、正常牙周膜成纤维细胞加内毒素、正常牙周膜成纤维细胞。噻唑蓝法检测各组细胞24h和48h的活力变化;PcDNA3.1(+)-可溶性肿瘤坏死因子受体转染细胞后,免疫组化染色强阳性表达,转染培养液培养实验组细胞24h和48h后,噻唑蓝法检测实验组牙周膜细胞的活力变化。结果:①正常牙周膜成纤维细胞与CD3+T淋巴细胞共培养,内毒素刺激正常牙周膜成纤维细胞后,细胞活性降低;培养24h和48h后,噻唑蓝法检测各组的A值:正常牙周膜成纤维细胞和CD3+T淋巴细胞共培养组,加入内毒素刺激,24h为4.6±0.2,48h为3.7±0.1;用PcD-NA3.1(+)-可溶性肿瘤坏死因子受体转染细胞的培养液培养,24h为7.8±0.3,48h为6.9±0.5;正常牙周膜成纤维细胞用内毒素刺激,24h为9.0±0.4;48h为8.7±0.3;单纯正常牙周膜成纤维细胞与CD3+T细胞共培养,24h为10.1±0.2,48h为9.8±0.5;单纯培养牙周膜成纤维细胞,24h为10.0±0.5,48h为9.2±0.1。②转染空质粒PcDNA3.1(+)的牙周膜成纤维细胞其可溶性肿瘤坏死因子受体表达不明显,而转染质粒PcDNA3.1(+)-可溶性肿瘤坏死因子受体的牙周膜成纤维细胞其可溶性肿瘤坏死因子受体表达增强。结论:内毒素与T淋巴细胞刺激正常牙周膜成纤维细胞可以引起肿瘤坏死因子α水平升高;可溶性肿瘤坏死因子受体对于炎症牙周膜成纤维细胞有抑制肿瘤坏死因子α作用的功能。