可注射自体脂肪组织移植动物模型的建立

目的:建立一种可注射自体脂肪组织移植的动物模型。方法:从6只新西兰家兔背部获取脂肪颗粒(adipose granule,AG),取部分AG经Ⅰ型胶原酶消化得到基质血管成分(stromal vascular fraction,SVF)。将自体SVF与AG复合作为实验组移植到兔右耳移植区,单纯AG为对照移植到兔左耳移植区。术后当日、1、3个月通过B超和游标卡尺测量移植物体积,并用透射光活体观察各时间点新生血管的形成。术后3个月取材,观察移植物组织学变化。结果:术后1、3个月对照组脂肪组织存活率分别为:(64.35±8.36)%、(58.22±2.88)%;实验组脂肪组织存活率分别为:(77.42±5.1)%、(67.95±6.09)%(P<0.05)。术后3个月,实验组与对照组组织学变化未见明显差异。结论:根据兔耳血管分布特点建立的动物模型具有标准统一、易于观察与测量、容易重复的特点,为脂肪组织工程研究提供了一种新的动物模型。

自体基质血管成分改善脂肪组织移植效果的实验研究

目的:分析自体脂肪基质血管成分(stromal vascular fraction cells,SVF)对脂肪颗粒(adipose granule,AG)移植的作用。方法:从6只健康新西兰家兔背部肩胛区获取脂肪组织,实验组将自体SVF与自体AG复合,植入家兔耳部皮下,对照为单纯脂肪移植。在术后1、3、6个月,用B超和游标卡尺测量移植脂肪体积;术后6个月取材常规组织学观察。结果:术后1、3、6个月对照组脂肪组织存活率分别为:(64.35±8.36)%、(58.22±2.88)%、(50.61±9.47)%;实验组脂肪组织存活率分别为:(77.42±5.1)%、(67.95±6.09)%、(72.75±4.37)%。两组比较均存在显著性差异(P<0.05)。术后6个月组织学观察两组呈正常脂肪组织形态,未见明显差异。结论:自体SVF复合脂肪颗粒能够显著提高移植脂肪组织的成活率,为临床脂肪移植提供实验依据。

兔脂肪干细胞的分离培养鉴定及诱导分化研究

目的:分离培养家兔脂肪干细胞(Adipose-derived stem cells,ASCs),观察体外培养生长特性,并在特定条件下诱导分化,探讨其成脂成骨分化能力。方法:无菌条件下切取家兔腹股沟处脂肪组织,0.25%Ⅰ型胶原酶消化,分离培养原代细胞,取第3代ASCs做实验,用HE染色观察细胞形态,MTT比色法测定细胞生长曲线;用流式细胞仪检测其细胞表面标志物;用油红O染色和茜素红染色鉴定成脂和成骨诱导分化。结果:从家兔脂肪组织中分离获得的ASCs形态为长梭形,成纤维细胞样,生长活力旺盛,具有较强的增殖能力;流式细胞仪分析CD29呈阳性表达,CD31呈阴性表达;成脂诱导的细胞油红O染色阳性,成骨诱导的细胞茜素红染色阳性。结论:本实验分离培养的细胞为ASCs,具有成脂和成骨分化潜能。

富血小板纤维蛋白体外释放VEGF影响因素的探讨

目的:探讨不同材质的离心管和储存温度对制备的富血小板纤维蛋白(platelet-rich fibrin,PRF)释放血管内皮生长因子(vascular endot helial growth factor,VEGF)的影响。方法:分别用玻璃离心管和塑料离心管从健康家兔耳中动脉采血制备PRF,制备成PRF膜片后,加入无菌DMEM培养液各分为两组置于37℃和4℃条件下,并分别从20min,4h,24h,72h,120h,168h,0～168h七个时间点收集PRF样本,用ELI SA试剂盒检测各时间点VEGF的含量情况。结果:4℃条件下保存的PRF膜片释放VEGF含量高于37℃,玻璃离心管制备的PRF释放的VEGF含量高于塑料离心管。结论:不同的材质离心管和不同的储藏温度对PRF的特性存在一定影响,PRF的制备宜用玻璃离心管,在使用前宜储藏于4℃条件下。

富含血小板血浆对组织工程脂肪移植效果的影响

目的:在移植的组织工程脂肪组织中加入含激活剂的富含血小板血浆(PRP)或不含激活剂的富含血小板血浆,通过观察脂肪组织各个时间段的成活率来证明PRP的作用。方法:根据Landesberg二次制备法制备PRP。按1000U凝血酶溶于1ml质量百分比为10%的CaCl2配制激活剂。从兔背部取脂肪组织制备好,按实验分组分别加入不同的成分移植到兔子耳部。分别在术后1月、3月、6月测量体积变化。结果:含激活剂的PRP加入组织工程脂肪移植后3个时间段的体积成活率均高于对照组。结论:加入激活剂的PRP释放生长因子增多,释放速度增加,间接促进了脂肪干细胞分裂、分化、成活,促进了移植脂肪组织的更新,使脂肪移植成活率增加。

自体ADSCs复合PRF修复家兔耳软骨缺损的实验研究

目的:将未诱导的自体脂肪干细胞(ADSCs)与富血小板纤维蛋白(PRF)复合,作为一种全新的软骨修复材料,探讨其对家兔耳软骨全层缺损修复的可行性。方法:取家兔10只,于每只家兔耳部做4处软骨全层缺损,随机分为A、B、C、D组,A组,作为空白对照;B组植入自体ADSCs;C组植入自体PRF;D组植入自体ADSCs与PRF的复合物。分别于术后1月、2月、3月取材,进行大体及HE染色观察,并使用IPP6.0软件对软骨生成量进行半定量分析。结果:HE染色显示,3月后,A组几乎无新生软骨生成,B、C、D三组软骨生成量依次增多,D组尤为明显。IPP6.0统计结果显示,移植物植入3月后,A组软骨缺损修复率为(1.68±0.17)%,B组为(15.4±0.91.)%,C组为(32.0±2.76)%,D组为(85.77±4.88)%。各组间有显著统计学差异,与HE染色结果相符。结论:未诱导的自体ADSCs复合自体PRF作为一种全新的软骨修复材料,可以有效的修复家兔耳软骨全层缺损,具有潜在的临床应用价值。

兔异体脂肪干细胞移植的实验研究

目的:建立一种可注射异体脂肪移植模型,观察兔异体脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)复合自体脂肪颗粒(adipose granule,AG)和富血小板纤维蛋白(platelet-rich fibrin,PRF)移植后的形态学和免疫学的变化,为临床异体脂肪干细胞移植提供一种实验依据。方法:取30只健康新西兰家兔,随机分成5组:A组,(N=6),移植物为自体AG;B组,(N=6),自体AG+自体PRF;C组(N=6),自体AG+自体ADSCs:D组(N=6),自体AG+自体PRF+自体ADSCs,E组(N=6),实验组,自体AG+自体PRF+异体ADSCs。在术后1、3、6个月,大体外观、HE染色分析其形态学改变;免疫组化、外周血淋巴细胞亚群CD4/CD8比值、血浆IL2和IL4分析其免疫学改变。结果:术后1、3、6个月在大体外观、免疫组化等D、E两组与A、B、C三组比较均有显著性差异(P<0.05)。E组在淋巴亚群CD4/CD8、血浆IL-2、IL-4等与D组比较均无显著性差异(P>0.05)。结论:异体ADSCs复合自体PRF、AG能够显著提高移植脂肪组织的成活率,并且无明显免疫排斥反应,可为临床异体脂肪干细胞移植提供实验依据。

小鼠脂肪来源干细胞体外培养、诱导分化及鉴定

目的:观察C57小鼠ASCs(Adipose-derived stem cells,ASCs)体外培养的生物学特性,探讨其成脂成骨诱导分化能力。方法:无菌条件下切取C57小鼠腹股沟处脂肪组织,0.25%I型胶原酶消化,分离培养ASCs,37℃,5%CO2饱和湿度孵箱培养,细胞融合达80%时消化传代。观察其细胞形态;MTT比色法测细胞生长曲线;流式细胞仪检测细胞表面标志物;取第2代细胞行成骨及成脂诱导培养,3周后分别茜素红染色和油红O染色鉴定。结果:从C57小鼠脂肪组织中分离获取的ASCs呈长梭形,成纤维细胞样。细胞生长曲线呈"S"型,证明ASCs具有很强的增殖能力;流式细胞术分析结果:CD29、CD44、CD90阳性表达,CD31、CD34、CD45阴性表达;成骨诱导后茜素红染色阳性,成脂诱导后油红O染色阳性。结论:本试验分离培养的细胞为ASCs,具有确切分化能力。