鼠牙胚的体外培养的实验观察

目的：组织学观察鼠牙胚的体外发育．方法：１７天大鼠（ＳＤ）胚胎的下颌第一磨牙置于微孔滤膜上培养，培养液为ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ，５０μｇ／ｍｌＶｉｔＣ．结果：体外牙胚可进一步发育，间质细胞分化为成牙本质细胞和形成前期牙本质．

Vitapex糊剂治疗恒牙根尖周病的临床效果观察

目的观察Vitapex对一些治疗困难或失败的根尖周病的消毒效果。方法共治疗54个牙,包括根管治疗期间出现的行多次常规根管消毒后,患牙仍有持续的根尖周症状;或根管内有较多的渗液,不能短期内完成根管治疗;或治疗失败,均用Vitapex糊剂充填根管。结果Vitapex糊剂用于根管消毒(充填),术后患牙自觉症状消失,根管内的渗液减少,窦道封闭。结论Vitapex糊剂有较长作用时间的抗菌性以及组织吸收性,Vitapex可作为解决根管治疗效果不佳的一种有效药物。

Notch信号分子于小鼠牙髓干细胞样细胞表达的研究

目的 研究Notch基因在小鼠牙髓干细胞样细胞表达。方法 采用酶消化培养法获得小鼠的单个牙髓细胞悬液 ,调整细胞密度为 1× 10 4 个 孔细胞 ,干细胞培养液培养 14d,挑选细胞克隆扩增 ,提取细胞的总RNA ,反转录聚合酶联反应 (RT_PCR)检测Notch基因的表达。结果 小鼠牙髓细胞呈集落状生长 ,克隆形成率约为 1 6～ 2 5个 10 4 细胞 ,所形成的集落细胞结合紧密 ,细胞胞体小、胞核大 ,RT_PCR结果显示Notch的mRNA在牙髓干细胞样细胞中有表达。结论 培养的集落状生长的小鼠牙髓细胞具有干细胞增殖快的特性 ,Notch基因于牙髓干细胞中表达 。

转化生长因子β1对人牙本质基质蛋白1基因转录活性的影响

目的:观察具有矿化活性的人牙髓干细胞(human dental pulp stem cell,HDPSC)在重组人转录生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)作用下对牙本质基质蛋白1(dentin matrix protein1,Dmp1)表达和Dmp1基因启动子转录活性的影响。方法:通过建立体外培养的HDPSC矿化诱导模型,经10ng/L重组人TGF-β1刺激后,运用RT-PCR、报告基因检测等方法检测细胞在TGF-β1作用后Dmp1mRNA表达变化以及对pGL3-P-193～+86和pGL3-P-505～+862个启动子片段重组报告基因载体活性的影响。结果:诱导矿化后具有部分成牙本质细胞样细胞特征的HDPSC经TGF-β1刺激后,Dmp1mRNA的表达水平明显下降,并存在时间依赖性。pGL3-P-193～+86和pGL3-P-505～+86相对荧光素酶活性均下降,以pGL3-P-505～+86活性下降更明显,说明TGF-β1具有下调HDPSCDmp1转录活性的作用。计算机分析结果发现,Dmp1基因启动子-505～+86bp区存在多个TGF-β1下游作用分子Smads的结合位点。结论:TGF-β1可下调Dmp1mRNA的表达水平和转录活性,以pGL3-P-505～+86活性下降更明显。启动子-505～-193bp区存在TGF-β1下游作用分子或转录因子的结合位点,从而参与下调Dmp1转录表达过程。

核心结合因子α1对人牙本质基质蛋白1基因转录活性的作用

目的:观察核心结合因子α1(core binding factorα1,Cbfα1)对人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,HDPSCs)牙本质基质蛋白1(dentin matrix protein 1,DMP1)基因转录活性的影响。方法:将pCMV-Osf2瞬时转染至体外矿化诱导的HDPSCs中,检测转染后不同时间Cbfα1蛋白的表达变化。将不同长度的DMP1基因启动子片段重组报告基因载体与pCMV-Osf2分别共转染至细胞中,报告基因检测系统检测荧光素酶活性。结果:诱导后的HDPSCs中少量表达Cbfα1,在瞬时转染Cbfα1后,蛋白主要表达于细胞胞质中,并且在转染48 h后表达量达到最高值;Cbfα1可明显增强6个不同长度的DMP1基因启动子片段重组报告基因载体的荧光素酶活性,以pGL3-P-505～+86启动子活性增强最为明显(P<0.05)。计算机分析结果发现,DMP1基因启动子-505～+86 bp区存在Cbfα1的结合位点。结论:Cbfα1可上调人DMP1基因转录活性,是HDPSCs向成牙本质细胞方向分化重要的调节因子之一,DMP1基因启动子序列-199～-185 bp区可能是Cbfα1结合位点。

草酸钾、聚丙烯酸处理牙本质玷污层的扫描电镜观察

高速牙钻切割牙本质表面后形成的玷污层,堵塞牙本质小管口,用水雾冲洗不能去除;用20％草酸钾液处理则可去除,并使牙本质表面具有抗酸性;用20％聚丙烯酸处理,也可去除,且牙本质小管口不扩大。

几种牙髓治疗药物的抗菌作用

本研究采用多种方法检验与评价几种牙髓治疗药物的抗菌作用,结果证实FC、愈创木酚等对金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、绿脓杆菌及产黑色素类杆菌、消化链球菌的作用最有效,而2.5%戊二醛的杀菌作用远不如FC和愈创木酚,依据实验结果,本文提出了这些药物的临床应用适宜剂量。

细胞内信号转导分子——Smad7在人牙胚发育中的表达和意义

目的 探讨Smad7在TGF_β调节牙胚发育过程中的作用。方法 采用免疫组化ABC法观察Smad7在人牙胚发育各个时期的表达分布及其变化情况。结果 人牙胚发育各个时期均表达Smad7,但各期分布模式有所不同。Smad7在不同发育时期牙胚中的分布与TGF_β及其特异的信号转导分子Smad2、3有相似之处。 结论 Smad7可能在TGF_β调节成釉细胞和成牙本质细胞分化的信号转导通路中起一定的作用。

牙本质涎磷蛋白反义核酸对牙胚超微结构的影响

目的 探讨牙本质涎磷蛋白 (DSPP)在牙胚发育和矿化中的作用及其机制。方法 胎龄为 17dBalb C胎鼠上颌第一磨牙 ,分为 2组 ,对照组牙胚置于无血清BGJb半固定培养基中培养 ;DSPP反义核酸组牙胚置于含有30 μmol L ,长 15bp的DSPP反义寡核苷酸的半固体培养基中培养。牙胚体外培养 10d后 ,进行透射电镜观察。 结果 2组牙胚牙尖处成牙本质细胞中均含有大量的细胞器 ,线粒体肿胀 ,粗面内质网扩张 ,且DSPP反义核酸组成牙本质细胞中粗面内质网扩张更为明显 ;胞外基质超微结构显示 :对照组胶原纤维聚集成束 ,排列具有一定的方向 ,牙尖基质带平均厚度为 3μm ;DSPP反义核酸组胶原纤维粗细不等 ,排列紊乱 ,牙尖基质带平均厚度为 2 5 μm。 结论 DSPP可能通过控制成牙本质细胞正常的分泌功能、胶原纤维的正常形态和排列在牙胚生长、矿化中起重要作用。

人牙本质基质蛋白1基因启动子在不同细胞中的活性比较和分析

目的观察并比较不同长度的人牙本质基质蛋白1(Dmp1)基因上游启动子片段在人牙髓干细胞(HDPSC)、成骨细胞(OC)和子宫颈癌上皮细胞株Hela中的启动子活性,为进一步研究Dmp1基因在矿化组织中的特异性转录调控特点和作用机制奠定基础。方法以获得正确序列的2 195 bp Dmp1基因上游启动子重组T载体为模板,通过 PCR方法获得不同长度的Dmp1基因上游启动子片段,将其构建至报告基因载体pGL3-Basic中,瞬时转染至HDP- SC、OC和Hela细胞,荧光素酶检测这些细胞中启动子活性并进行分析。结果成功地获得了6段不同长度的Dmp1 启动子目的片段。酶切鉴定表明不同长度启动子报告基因载体构建成功,不同片段的Dmp1启动子在不同细胞中活性不同,在HDPSC和OC中活性较强,而在Hela细胞中活性最低。在-505--193 bp区和-935--505 bp区可能分别存在HDPSC和OC较为特异的转录调控作用区域点,该区可能包含Dmp1表达的基础调控元件。结论成功克隆了不同长度的Dmp1上游启动子的序列,不同启动子片段在牙髓干细胞和成骨细胞等矿化性细胞中活性较强,并初步确定了Dmp1启动子在矿化性细胞中的基本启动子区域,而在非矿化性细胞Hela细胞中活性较低。

转化生长因子β1和重组人骨形成蛋白2对成牙本质细胞系MDPC-23牙本质基质蛋白1表达的影响

目的 观察转化生长因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)和重组人骨形成蛋白2(bone morphogenic protein 2,rhBMP2)单独或联合作用对小鼠成牙本质细胞系 MDPC-23牙本质基质蛋白 1(dental matrix potein,DMP1)合成分泌的影响。方法 利用不同浓度的TGF-β1和rhBMP2以及二者联合刺激培养MDPC-23细胞,用免疫组化SABC方法和图像分析观察分析结果。结果 2μg/L的 TGF-β1能够增强 MDPC-23细胞 DMP1的表达;不同浓度的 rhBMP2均可增强细胞 DMP1的表达量,呈浓度依赖性增强;2μg/L的 TGF-β1和不同浓度的 rhBMP2联合应用可明显增强 DMP1的表达。诱导的 DMP1主要表达于胞质和细胞突起中。结论 TGF-β1和rhBMP2单独和联合应用能够增强成牙本质细胞系MDW-23产生DMP1,二者联合应用作用更加显著,说明二者对成牙本质细胞的分泌和成熟有一定促进作用。

变异链球菌LuxS基因表达载体的构建

目的构建可用于变异链球菌表达系统的含LuxS基因的原核表达载体。方法应用聚合酶链反应(PCR)方法分别从变异链球菌的DNA、载体pEGFP-N1中扩增出LuxS基因的启动子(pLuxS)和绿色荧光蛋白(gfp)基因片段,经回收、纯化后,利用分子克隆技术分别克隆入载体pUC19中。结果通过对重组质粒pUC19-pLuxS-gfp的酶切图谱和DNA序列测定分析证实插入片段序列正确。结论成功构建出原核表达重组质粒pUC 19-pLuxS-gfp为下一步的功能研究奠定了基础。

变形链球菌高毒力株特异DNA片段的序列测定及生物信息学分析

目的将筛选得到的变形链球菌高毒力株特异的DNA片段序列与数据库中已知序列进行对比,发现高毒力株特异的新基因或已知基因的新功能,推测、鉴定基因所编码蛋白质的功能。方法对筛选得到的c血清型变形链球菌高毒力株特异的31个DNA片段进行序列测定,利用BLAST2.2.6程序进行核苷酸和含6相位阅读框架编码的氨基酸的相似性检索。结果变形链球菌高毒力株特异的31个DNA片段中,2个为重复克隆,片段大小在113～776bp之间,平均G+C含量为38.59%,与已完成测序的变形链球菌UA159基因编码区的G+C含量相近。发现了5个新的基因片段,其余的片段均与变形链球菌UA159基因组中的基因有高度的同源性。依据推测的功能,高毒力株特异的DNA片段主要与信号转导及转录调节、修复应激损伤、生化代谢、外膜蛋白合成及粘附以及目前功能仍未知或不确定的假想蛋白有关。结论利用生物信息学相关软件及数据库进行c血清型变形链球菌高毒力株特异DNA片段的基因分析、识别及功能预测,发现了5个新的基因片段以及高毒力株特异的DNA片段的主要功能,为进一步的基因功能研究奠定基础。

应用组织芯片技术分析宫颈癌组织中Bit 1基因的表达

目的:对比研究Bit1基因在正常宫颈组织和不同分化程度的宫颈癌组织中的表达情况。方法:应用组织芯片技术,通过免疫组织化学方法检测84例宫颈癌标本和74例正常宫颈组织标本中Bit1基因的表达情况。结果:Bit1基因在宫颈癌和正常宫颈组织中的表达阳性率分别为66.7%和83.8%,有显著统计学差异(P<0.05);Bit1基因在不同分化程度的宫颈癌组织中的阳性率分别为:低分化鳞状细胞癌,52.9%;中分化鳞状细胞癌,78.6%;高分化鳞状细胞癌,87.5%。统计学分析发现,Bit1基因在不同分化程度的的宫颈癌组织中的表达存在显著的统计学差异(P=0.028)。结论:Bit1基因在正常宫颈组织中的表达明显高于宫颈癌组织,而且宫颈癌组织中Bit1基因的表达与分化程度密切相关。

利用抑制消减杂交技术构建变形链球菌高毒力株特异的基因文库

目的构建c血清型变形链球菌高毒力株特异的基因文库,为变形链球菌毒力基因的筛选奠定基础.方法从一对c血清型变形链球菌高、低毒力株中提取基因组DNA,用四碱基限制性内切酶酶切,以高毒力株的DNA酶切产物为tester DNA,低毒力株的DNA酶切产物为driver DNA,tester DNA连接接头后与driver DNA进行抑制消减杂交,并检测连接效率与消减效率.将获得的消减PCR产物与pCR2.1载体连接,转化E.coliTOP10F'感受态细胞,进行蓝白筛选.结果从识别四碱基序列的限制性内切酶中,筛选出Alu工,用于制备变形链球菌基因组DNA的代表性片段,产生的酶切产物位于0.1～2.0kb.testerDNA与接头的连接效率大于25%,抑制消减杂交后消减效率检测显示,同时存在于tester与driver DNA中的23S rRNA基因在消减组中出现时间较未消减组晚6个循环,将消减PCR产物克隆后,挑取96个转化子,构建高毒力株特异的基因文库.结论利用抑制消减杂交技术,进行c血清型变形链球菌高、低毒力株之间基因组DNA的比较,初次构建了高毒力株特异的基因文库.

变形链球菌葡聚糖结合蛋白A真核表达质粒pcDNA3.1/GBD在哺乳动物细胞中的表达

目的 观察变形链球菌葡聚糖结合蛋白A(GbpA)的葡聚糖结合区 (GBD)真核表达质粒pcDNA3 1 GBD在哺乳动物细胞COS_7的表达情况。方法 通过基因重组技术构建真核表达质粒pcDNA3 1 GBD ,通过脂质体转染法将其转染至COS_7细胞 ,通过免疫组化SABC法检测其在COS_7细胞的表达。结果 pcDAN3 1 GBD质粒转染的细胞质呈棕黄色染色 ,胞核无着色 ,pcDAN3 1空载体转染的细胞质及胞核无着色 ,空白对照组也无着色。结论 质粒pcDAN3 1 GBD转染COS_7后能够在细胞内翻译、表达 ,表达的蛋白质位于细胞质中 ,可与抗GbpA抗体特异性结合 ,具有抗原性 。

PcDNA3.1(+)-sTNFRⅠ真核表达载体在牙周膜细胞中的表达研究

目的:构建真核表达质粒PcDNA3.1(+)-sTNFRⅠ,并转染人牙周膜细胞观察是否有目的产物的表达,研究其是否具有生物学活性,为进一步研究其在牙周治疗中的作用提供实验基础。方法:RT-PCR方法筛选目的基因,并构建质粒;ELISA方法检测牙周膜细胞转染PcDNA3.1(+)-sTNFRⅠ后培养上清中目的基因的表达;MTT检测目的产物是否在牙周膜细胞中有抑制TNF-α的作用。结果:成功重组构建了质粒PcDNA3.1(+)-sTN-FRⅠ,转染牙周膜细胞后,培养上清中目的产物sTNFRⅠ表达量实验组显著高于对照组,MTT检测表明表达产物具有生物学活性。结论:质粒PcDNA3.1(+)-sTNFRⅠ可以在牙周膜细胞中高效表达,并且可以抑制肿瘤坏死因子(TNF-α)的活性。为进一步研究TNFR在牙周病中的致病作用提供依据。