复层牙周膜细胞膜片组织再生的实验性研究

目的:制备复层牙周膜干细胞膜片(MUCPs)与单层牙周膜干细胞膜片(MCPs),并评价其生物学活性和组织再生能力。方法:将构建的2种细胞膜片通过免疫组化和扫描电镜等方法观察其生物学活性。再将2种膜片分别与2种支架材料陶瓷牛骨(CBB)与预处理牙本质片(TDM)复合构建不同的生物性牙根,植入裸鼠皮下,观察组织再生情况。结果:体外结果显示MUCPs高表达Col-I、COL-III、Fibronectin、Laminin等细胞外基质的结构蛋白。体内结果显示在复层细胞膜片组可以观察到再生出更明显的类似于牙周复合组织的矿化沉积和牙周膜样纤维。结论:MUCPs具有更为良好的生物学活性和组织再生能力,将为临床牙周组织缺损的治疗提供一种新的治疗方法。

肝组织细胞外囊泡调节间充质干细胞成骨分化促进颌骨缺损愈合初探

目的探讨肝组织细胞外囊泡(LT-EV)促进间充质干细胞成骨分化并治疗小鼠颌骨缺损的生物学过程,以期为临床颌骨缺损治疗提供一种可行的治疗方式。方法使用酶解法和差速离心法提取小鼠LT-EV,使用扫描电镜、蛋白质印迹和纳米粒子跟踪分析仪鉴定和表征LT-EV,并通过蛋白组学、京都基因和基因组数据库通路分析进一步探索LT-EV的生物学功能。使用流式细胞术检测LT-EV血浆浓度,计算LT-EV的血浆半衰期。使用小动物活体成像系统检测小鼠注射LT-EV 24 h后的生物学分布。通过简单随机抽样法将6只C57BL/6小鼠分为对照组和LT-EV组(每组3只),所有小鼠行颌骨缺损手术,每7天行尾静脉注射(对照组注射磷酸盐缓冲液,LT-EV组注射LT-EV),术后28 d使用显微CT检测小鼠颌骨愈合程度,通过HE染色分析LT-EV的多器官生物安全性,使用免疫荧光染色检测颌骨缺损区域成骨标志蛋白表达量。采用LT-EV处理成骨分化诱导的人颌骨间充质干细胞(hJBMSC)(取自空军军医大学第三附属医院创伤与正颌外科提供的正颌手术患者手术切除的正常颌骨骨片),并比较hJBMSC组与对照组(磷酸盐缓冲液处理)细胞成骨分化能力差异,通过碱性磷酸酶(ALP)染色和实时定量PCR(qRT-PCR)验证LT-EV的体外促成骨分化作用。结果LT-EV产量较高,蛋白组学与京都基因和基因组数据库通路分析显示,LT-EV含有调节细胞生物功能的系列蛋白质。尾静脉注射的LT-EV可到达小鼠颌骨缺损区域,并促进颌骨缺损的再生修复[LT-EV组和对照组骨体积分数分别为(36.06±4.20)%和(18.58±5.61)%;t=4.32,P=0.013],且具有良好的生物安全性。LT-EV在体外可以促进hJBMSC成骨分化,相比对照组,hJBMSC组成骨分化后ALP染色和成骨基因表达水平均显著增强(P<0.05)。结论LT-EV产量大、易获取、生物安全性高并具备优良的促成骨作用,有望成为颅颌面骨骼缺损再生的无细胞疗法新策略。

去势大鼠骨髓间充质干细胞的成脂向分化

背景:骨髓间充质干细胞在适宜条件下,其成脂向分化增强可促进机体内脂肪细胞的生成。目的:观察去势对大鼠体质量的影响,从骨髓间充质干细胞功能变化角度分析其病理机制。方法:选用同一批次、周龄相同、体质量相近的健康雌性SD大鼠,分为2组,去势组行双侧卵巢切除建立骨质疏松症模型,假手术组部分切除双侧卵巢附近脂肪组织。3个月后显微CT检测两组大鼠股骨骨质量及体质量。分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,体外传至第5代,成脂诱导后脂滴油红O染色法检测骨髓间充质干细胞成脂能力;反转录-聚合酶链反应法检测骨髓间充质干细胞成脂相关蛋白过氧化物酶体增殖物激活受体γ及脂蛋白酯酶mRNA表达。结果与结论:去势3个月后,大鼠骨质疏松症模型成功构建。与假手术组相比,去势组大鼠股骨骨质量明显降低,体质量有明显增加,骨髓间充质干细胞成脂向分化增强(P<0.05)。提示骨髓间充质干细胞成脂向分化增强可能是大鼠去势后体内脂量生成增多,引起体质量肥胖性改变的重要原因。

早衰小鼠骨髓间充质干细胞电压门控钙通道的表达检测

目的:研究早衰小鼠骨髓间充质干细胞(BMMSCs)的成骨分化特点以及电压门控钙通道的表达特点。方法:用micro-CT检测zmpste24-/-早衰小鼠和野生小鼠的骨量差异;分离培养两者的BMMSCs,并取第2代细胞分别检测其成骨能力以及胞内钙离子的浓度,采用RT-PCR方法检测两种小鼠BMMSCs中电压门控钙通道(10种亚型)的表达水平。结果:与野生型小鼠相比,zmpste24-/-早衰小鼠的骨量、其BMMSCs的成骨分化能力和胞内钙离子浓度均明显降低(P<0.05);RT-PCR检测结果显示,电压门控钙离子通道的10种亚型在两者BMMSCs中均有表达,其中Cav1.1、Cav1.2、Cav2.1和Cav2.2在早衰小鼠BMMSCs中的表达水平均明显低于野生小鼠组(P<0.05)。结论:在早衰过程中,电压门控钙离子通道可能参与了BMMSCs介导的骨质疏松。

亚精胺促进雌激素缺乏小鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化并抑制其成脂分化

目的研究亚精胺(SPD)对骨髓间充质干细胞(BMMSC)分化能力的影响。方法雌性C57/BL6J小鼠分为假手术(Sham)组、卵巢摘除术(OVX)组。术后2月,分离、培养OVX组和Sham组C57BL/6J小鼠的BMMSC。经Western blot法检测对比2组BMMSC的碱性磷酸酶(ALP)、runt相关转录因子2(Runx2)以及过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、脂蛋白脂解酶(LPL)的蛋白水平,茜素红染色对比2组BMMSC的矿化程度差异,油红O染色对比2组BMMSC脂滴数量差异。以SPD干预OVX组小鼠的BMMSC,Western blot法检测Runx2、ALP、PPARγ、LPL蛋白水平,反转录PCR检测Runx2、ALP、PPARγ、LPL mRNA水平;茜素红染色检测矿化结节及油红O染色检测脂滴数量。结果 OVX组小鼠来源的BMMSC成骨分化能力低于Sham组,成脂能力高于Sham组。经SPD干预后,OVX来源的BMMSC的成骨分化能力较未干预增强,成脂分化能力减弱。结论 SPD能够促进雌激素缺乏所致骨质疏松小鼠BMMSC的成骨分化并抑制其成脂分化。

自然衰老小鼠骨髓间充质干细胞增龄性改变的研究

目的:探讨自然衰老小鼠骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)在衰老过程中生物学特点的改变。方法:分离、培养年轻(2月龄)、年老(16月龄)C57/BL6J小鼠的BMMSCs,经干细胞表面分子鉴定后,Western Blot检测2组BMMSCs的Tert、Acetyl-P53蛋白表达水平;氧化应激活性氧(ROS)试剂盒检测ROS表达水平;流式细胞仪检测并比较两组细胞的增殖、凋亡状态。结果:年轻、年老小鼠BMMSCs阳性表达Sca-1,阴性表达CD34、CD45,符合间充质干细胞表达特性;年老小鼠BMMSCs Tert蛋白表达水平明显低于年轻组(P<0.05),Acetyl-P53蛋白表达水平明显高于年轻组(P<0.05);年老细胞ROS表达水平明显高于年轻组;年老细胞的增殖能力明显低于年轻组(P<0.05),而凋亡水平则明显高于年轻组(P<0.05)。结论:年老小鼠BMMSCs出现增龄性变化,这些变化可能在骨衰老中起着重要作用。

交感神经信号调控骨髓间充质干细胞成骨分化

目的：探讨交感神经信号对骨髓间充质干细胞（BMMSCs）成骨分化能力的调控作用。方法：体外培养6-7周龄C57小鼠的BMMSCs,经干细胞表面分子鉴定后,取P1代细胞铺板,随机分为4组：A组加入常规α-MEM、B组加入单纯成骨诱导液、C组加入含10μmol/L普萘洛尔（PRO）的成骨诱导液、D组加入含10μmol/L异丙肾上腺素（ISO）的成骨诱导液进行培养。于培养7、14 d时,分别采用ALP染色和茜素红染色观察各组细胞的成骨能力,RT-PCR和Western blot法检测细胞中骨桥蛋白（OPN）的表达水平。结果：PRO对BMMSCs的成骨分化能力具有明显促进作用（P〈0.05）,而ISO则对BMMSCs的成骨分化具有明显抑制作用（P〈0.05）;RT-PCR和Western blot检测显示,BMMSCs在PRO刺激下其OPN mRNA及蛋白的表达水平均明显上调（P〈0.05）,而在ISO作用下则均明显下调（P〈0.05）。结论：交感信号可直接调控BMMSCs成骨分化能力。

Zmpste24^(-/-)小鼠骨髓间充质干细胞的增殖凋亡及其TRP通道的表达研究

目的:探讨Zmpste24^(-/-)小鼠骨髓间充质干细胞(BMMSCs)的增殖凋亡情况及瞬时性受体电位通道(TRP通道)表达水平与野生型(WT)小鼠的区别。方法:体外分离培养4月龄Zmpste24^(-/-)和WT小鼠的BMMSCs,经干细胞表面分子鉴定后,分别采用β-半乳糖苷酶试剂盒检测两种小鼠细胞的衰老情况;流式细胞仪检测小鼠细胞的增殖、凋亡情况;实时定量RT-PCR检测两种小鼠细胞的TRP通道表达水平;激光共聚焦显微镜检测两种小鼠的细胞内Ca2+浓度。结果:Zmpste24^(-/-)和WT小鼠的BMMSCs均阳性表达Sca-1,阴性表达CD34、CD45。Zmpste24^(-/-)小鼠BMMSCs的衰老细胞数目和凋亡水平明显高于WT小鼠(P<0.05),而其增殖能力则明显低于WT小鼠(P<0.05);TRPC1、TRPM4、TRPM8、TRPV1、TRPV2、TRPV3、TRPV5通道的表达水平均明显高于WT小鼠(P<0.05);胞内Ca^(2+)浓度明显高于WT小鼠(P<0.05)。结论:Zmpste24^(-/-)小鼠BMMSCs的增殖率降低、凋亡率升高可能与其TRP通道高表达、胞内钙离子浓度升高有关。

间充质凝聚指导牙发育与再生的理论与实践

间充质干细胞在基因以及微环境的时空调控下可自发聚集形成致密化区域,这一现象称为间充质凝聚。间充质凝聚是跨物种保守的发育事件,对启动牙及全身器官的形态发生至关重要。间充质干细胞在培养中也具有自组装聚集能力,利用此特性构建干细胞聚合体以模拟发育性间充质凝聚已成为一种具有应用前景的再生医学手段。本文讨论间充质凝聚的原理及其在牙形态发生中的作用与机制,并总结干细胞聚合体的工程化构建策略及应用于牙再生领域的实践经验,旨在从"发育指导再生"的理念出发,为理解干细胞发育生物学和建立新的器官再生策略提供参考。

冻干牙的制备及其生物学性能检测

目的检测和分析冻干牙的机械性能以及生物相容性,探讨其作为牙再生支架材料的可行性。方法临床收集单根的多生牙及正畸拔除牙,通过牙体预备、脱脂、去蛋白、深冷冻、冷冻干燥、消毒灭菌等过程制备冻干牙;首先利用扫描电镜观察其表面形态和微观结构,显微硬度测试其机械性能;进而将人乳牙牙髓干细胞(SHED)和冻干牙片进行复合培养,电镜观察细胞形态变化,Hoechst染色后观察SHED细胞数目的变化,四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测冻干牙对SHED增殖活性的影响。结果经过冻干处理的牙根表面及髓腔清洁,并保持完整的牙齿微观结构;冻干牙的显微硬度和正常对照牙无显著差别;冻干牙片表面SHED黏附生长情况要优于正常牙片,此外活细胞数量与正常对照在培养18h时差异有统计学意义(P<0.05);而冻干牙对SHED增殖活性的影响低于与正常对照。结论制备的冻干牙不仅保持原有的形态结构和机械性能,并且与具有良好的生物相容性,是一种理想的牙再生支架材料。

静态压力对人牙周膜干细胞凋亡相关蛋白表达的影响

目的:探讨体外模拟正畸牙移动过程中机械压力对人牙周膜干细胞(HPDLSC)凋亡相关蛋白表达的影响。方法:将体外培养的HPDLSC分别在自行研发的加压力装置中进行100、200 Kpa加压1、6和12 h后,检测和比较其凋亡相关蛋白caspase-3和caspase-8的表达;流式细胞仪检测其凋亡状态。结果:100 Kpa加压1 h的HPDLSCs中caspase-3和caspase-8的蛋白表达及其凋亡水平均显著高于对照组(P<0.05),而加力12 h的HPDLSCs中caspase-3和caspase-8的蛋白表达和凋亡水平与对照组比较无统计学差异(P>0.05)。200 Kpa加力1 h的HPDLSCs中caspase-3和caspase-8的蛋白表达和凋亡水平均显著低于对照组(P<0.05),而加力12 h的HPDLSCs中caspase-3和caspase-8的蛋白表达和凋亡水平与对照组比较无统计学差异(P>0.05)。结论:在体外模拟正畸牙移动过程中,不同强度静态压力作用不同时间对人牙周膜干细胞的凋亡作用不同,100 Kpa静态加力加压1 h可更有效地促进人牙周膜干细胞的凋亡,而200 Kpa静态加力加压1 h可抑制人牙周膜干细胞的凋亡。