兔Perthes病模型的建立及VEGF表达的实验研究

目的建立兔Perthes病模型并探讨Perthes病程中股骨头局部VEGF表达的变化及意义。方法3月龄新西兰大白兔24只,体重1.6～1.8kg。取16只兔作为实验组,手术切断左侧圆韧带和股骨头支持带血供,建立兔Perthes病模型;剩余8只作为对照组,按照上述程序左侧股骨头进行手术,但不打开关节囊,保持股骨头正常血供。于术后1、2、4、8周分别处死动物,取出股骨头,行大体观察、X线片、组织学、VEGF免疫组织化学染色和VEGF mRNA原位杂交观察。结果实验组动物模型均制备成功,术后5d感染1例,退出实验。大体观察:对照组各时间点股骨头未见坏死改变;实验组股骨头随时间延长逐渐粗糙、失去光泽,变小,可见塌陷。X线片观察:术后1、2周,两组股骨头无明显差异;4、8周,实验组股骨头较对照组密度增高。对照组各时间点HE染色均未见股骨头坏死及修复改变;实验组术后4、8周可见血管及肉芽组织侵入,新骨形成,参与修复。免疫组织化学:对照组股骨头骺软骨中,肥大区表现出较高的VEGF免疫反应性(VEGF immunoreactivity,VEGF-IR),而增殖区VEGF-IR却表现较低水平。术后1周,实验组股骨头增殖区VEGF阳性细胞率开始高于对照组,实验组股骨头肥大区VEGF阳性细胞率明显减少。术后8周,实验组股骨头整个骺软骨区均表现VEGF-IR,增殖区VEGF阳性细胞率较对照组明显增加;坏死股骨头软骨内骨化中心修复重建,肥大区VEGF阳性细胞率较正常接近。术后1、2、4、8周,实验组骺软骨增殖区VEGF阳性细胞率与对照组比较均有统计学意义(P<0.01);术后1、2、4周,实验组骺软骨肥大区VEGF阳性细胞率与对照组比较均有统计学意义(P<0.01)。原位杂交观察结果与免疫组织化学染色观察相似。缺血性坏死后,实验组肥大区VEGF mRNA表达丧失,增殖区VEGF mRNA表达升高。软骨内骨化中心修复重建后,实验组可见新形成的肥大区重新表达VEGF mRNA。结论VEGF在坏死股骨头骺软骨促进血管发生、软骨内骨化中心的修复重建方面起关键的调节作用。

计算机多媒体应用于骨科教学的思考

本文描述了计算机多媒体教学法的含义,并且针对骨科教学形象性强、操作性强和知识更新快的特点,分析了计算机多媒体对骨科教学的影响.论述了骨科计算机多媒体教学对教师的要求,以及教学模式的选择.

3种术式治疗Perthes病的临床比较研究

目的比较研究3种手术治疗Perthes病的临床效果。方法将33例(34髋)Perthes患儿分为A组(滑膜切除+带血管蒂髂骨瓣植骨12髋)、B组(Salter或Chiari骨盆截骨术15髋)和C组(转子间内翻截骨术7髋),平均年龄7.5岁,CatterallⅡ期11例,Ⅲ期16例(17髋),Ⅳ期6例,平均随访时间4年,根据X线和临床表现比较分析手术后优良率。结果3组优良率分别为A组83.3%、B组80.0%、C组57.1%,A组和B组差异无显著性,但与C组比较差异具有显著性(P<0.05)。结论滑膜切除结合带血管蒂髂骨瓣植骨,以及Salter或Chiari骨盆截骨术是治疗Perthes病的有效方法,分别适于Ⅱ期以前、病程较短、年龄偏小的患儿,以及Ⅲ期患儿,但须固定时间长,负重晚。转子间内翻截骨术适于CatteralⅢ期、年龄小于10岁的患者,或CatterallⅣ期有股骨头半脱位、头臼不相称的患者。

磷酸钙/纤维蛋白胶复合支架材料的结构及力学性能分析

用可吸收磷酸钙骨水泥和纤维蛋白胶按一定比例体外构建复合支架材料，通过XRD、SEM、抗压实验和空隙率测试等方法对其结构及力学性能进行分析。结果发现：由于加入纤维蛋白胶，复合支架材料在一定程度上延长了磷酸钙骨水泥的初凝时间，但并不影响磷酸钙骨水泥的终凝时间；同时，加入纤维蛋白胶改变了骨水泥固化体的微观结构，提高了骨水泥的抗压强度，其最大抗压强度达到14MPa，弹性模量在96．64～269．39MPa之间，空隙率为38．8％。与在同样条件下制备的磷酸钙骨水泥比较，复合支架材料的抗压强度增强了55．6％，而空隙率仅仅下降了6．9％；XRD分析显示，复合支架材料并不影响磷酸钙骨水泥的最终的转化，其结晶结构仍是羟基磷灰石结构，是更好的骨组织工程支架材料。

绿色荧光蛋白标记基因体内示踪骨髓间充质干细胞的分化

目的利用绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）标记技术,观察组织工程骨在体内形成过程中种子细胞的变化与转归。方法Adeno-X^TM-GFP扩增和纯化后,测定病毒滴度,感染新西兰大白兔骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）,倒置相差显微镜观察细胞形态变化,并在荧光显微镜下观察GFP表达情况。确认标记成功后,将其与未标记的兔MSCs共同成骨诱导培养3周后,接种于磷酸钙骨水泥（calcium phosphate cement,CPC）-纤维蛋白胶（fibrin glue,FG）复合支架材料,构建组织工程骨作为实验组,回植于供体兔皮下。单纯CPC-FG复合支架材料植入对称部位作为对照。术后1、2、3周行碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性测定;4周,激光共聚焦显微镜下对GFP进行示踪观察和型胶原、骨钙素（osteocalcin,OC）免疫组织化学检测成骨细胞功能蛋白,Masson染色观察新骨形成。结果Adeno-X^TM-GFP经扩增和纯化后,病毒噬菌斑形成,测得病毒滴度为3×108pfu/ml。Adeno-X^TM-GFP感染MSCs后96h,可见GFP表达,感染率达50%～70%,细胞分裂增殖基本正常。术后1、2、3周,实验组ALP活性分别为12.546±1.091、16.567±0.659和20.443±0.706,对照组分别为0.453±0.113、0.243±0.018和0.308±0.056,差异有统计学意义（P〈0.05）。4周,实验组大体可见组织工程新骨形成,对照组未见新骨形成;组织学显示实验组新生骨小梁围绕材料孔隙形成,CPC-FG复合支架材料部分降解;实验组型胶原、OC免疫组织化学结果阳性,对照组未见阳性染色;实验组可见新生组织内有GFP标记的细胞。结论组织工程骨组织结构与松质骨小梁类似,新生组织表达GFP,提示组织工程骨组织的形成来源于接种的细胞。

碱性成纤维生长因子和人重组骨形态发生蛋白2诱导分化兔骨髓间充质干细胞(英文)

背景:骨髓间充质干细胞依赖特定的生长和分化因子能分化为骨、软骨、脂肪等不同组织。人重组骨形态发生蛋白2有明显的骨诱导作用,能诱导未分化的骨髓间充质干细胞不可逆地形成骨与软骨,并最终导致新骨生成;碱性成纤维生长因子亦参与调控骨髓间充质干细胞的软骨与骨的分化。目的:观察碱性成纤维生长因子和人重组骨形态发生蛋白2对兔骨髓间充质干细胞增殖和分化的影响,以便寻求合适的骨形成诱导方法以代替常规的成骨培养体系。设计:随机对照实验。单位:解放军第四军医大学唐都医院骨肿瘤研究所。材料:培养的兔骨髓间充质干细胞。方法:实验于2004-06/12在第四军医大学唐都医院骨肿瘤研究所暨全军骨科中心完成。①体外培养的兔骨髓间充质干细胞分别经3种不同的生长因子(100μg/L人重组骨形态发生蛋白2,100μg/L碱性成纤维生长因子,100μg/L人重组骨形态发生蛋白2加100μg/L碱性成纤维生长因子)和成骨培养体系处理。②其增殖和分化通过四甲基偶氮唑盐比色法,碱性磷酸酶、骨钙素检测和钙结节VonKossa染色观察。主要观察指标:通过检测增殖率和碱性磷酸酶活性比较不同生长因子对兔骨髓间充质干细胞增殖和分化的影响。结果:①人重组骨形态发生蛋白2能促进兔骨髓间充质干细胞的增殖和分化,特别是其分化。②碱性成纤维生长因子能刺激兔骨髓间充质干细胞的增殖,与对照组相比,细胞增值率提高近100%;虽然对兔骨髓间充质干细胞分化无明显影响,但其能促进人重组骨形态发生蛋白2对兔骨髓间充质干细胞分化。结论:碱性成纤维生长因子和人重组骨形态发生蛋白2是兔骨髓间充质干细胞有效的分化因子,两者在体外都能促进兔骨髓间充质干细胞的增殖和分化。碱性成纤维生长因子和人重组骨形态发生蛋白2能协同作用加速骨诱导及骨形成,可以用作分化骨组织工程中的种子细胞。

hBMP-2基因转染兔骨髓间充质干细胞的表达及生物学效应的观察

目的:观察人骨形态发生蛋白-2(humanbonemorphogeneticprotein-2,hBMP-2)基因转染兔骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSCs)后的表达及表达产物对BMSCs增殖和向成骨细胞分化的影响。方法:利用腺病毒表达载体Adeno-XTM将hBMP-2基因转染兔BMSCs,用免疫组化染色。检测细胞内BMP-2的表达。然后通过MTT法分析其对细胞增殖的影响,并分别通过体外检测Ⅰ型胶原合成和表达情况、碱性磷酸酶染色和钙结节VonKossa染色,观察腺病毒介导hBMP-2基因转染兔BMSCs的成骨分化能力。结果:转基因细胞6周时仍能表达外源性基因。基因表达产物hBMP-2能明显促进BMSCs的增殖以及I型胶原的合成,转染后第14天碱性磷酸酶染色多数细胞为阳性,第21天出现钙结节。结论:hBMP-2基因转染BMSCs后可获得稳定表达,且基因表达产物能促进BMSCs增殖,并诱导其向成骨细胞分化。

自体移植兔静脉细胞增殖与钙激活钾通道的变化

目的 :研究静脉移植后钙激活钾通道 (KCa)的变化 ,并探讨其病理生理意义。方法 :将兔的双侧股静脉倒置移植于同侧股动脉缺损之间 ,采用离体血管灌流的方法 ,测定移植静脉环的张力。分别以图像分析和四唑盐(MTT)比色法检测移植静脉内膜增厚的程度以及KCa的阻断剂盐酸四乙胺 (tetraethylammoniumchloride ,TEA)对培养的家兔股静脉血管平滑肌细胞 (vascularsmoothmusclecells,VSMCs)增殖的影响。进而采用膜片钳技术记录KCa电流。结果 :移植后 1week ,静脉的收缩性和内膜相对厚度没有显著变化。静脉移植后 2weeks,收缩性和内膜相对厚度显著大于对照组 (P <0 0 5 ,n =8)。移植后 4weeks静脉的收缩性和内膜相对厚度进一步大于对照组 (P <0 0 1,n =8)。TEA(2 - 8mmol/L)显著增加培养VSMCs的MTT吸光值 ,并且有剂量依赖性 (P <0 0 5 ,n =8)。膜片钳实验结果显示 ,指令电位在 (30 - 6 0 )mV时 ,移植 (1- 4 )weeks静脉VSMCs的KCa电流密度均显著低于对照组 (P <0 0 5 ,n =5 ) ,指令电位在 2 0mV时 ,只有移植 4weeks静脉VSMCs的KCa电流密度显著低于对照组 (P <0 0 5 ,n =5 )。结论 :自体移植静脉VSMC的KCa受到抑制 ,可能是血管收缩性增强、VSMCs异常增殖的原因 ,从而导致自体移植静脉痉挛和狭窄。

内皮素A型受体反义基因减弱内皮细胞条件培养液刺激的血管平滑肌细胞增殖

目的 :研究内皮素 (Endothelin,ET) A型受体 (ETA)反义寡核苷酸 (Oligonucleotide,OGN)对内皮细胞 (En-dothelial cells,ECs)条件培养液 (ECCM)刺激的人大隐静脉 (hum an saphenous vein,HSV)血管平滑肌细胞 (Vas-cular sm ooth m uscle cells,VSMCs)增殖的影响。方法 :分离、培养 HSV的 ECs和 VSMCs。收集 ECCM,分别用正常的 DMEM(Dulbecco's Mod Ified Eagle medium )、含 ET- 1的 DMEM、ECCM和加入 Phophoramidon(ET- 1转化酶抑制剂 )的 ECCM培养 VSMCs。以放射免疫法测定 ECs培养基中 ET- 1水平 ;分别采用放射受体结合分析法和四唑盐 (MTT)比色实验检测 ETA 蛋白表达和细胞的增殖。结果 :ETA- OGN(15 μm ol/L)以时间依赖的方式抑制ETA 表达。 12～ 4 8h HSV的 ECs培养上清液 ET- 1水平呈现上升的趋势 ,4 8h达到高峰。 ECCM显著刺激 VSMCs增殖 (P<0 .0 1) ,ET- 1能够模拟 ECCM的促增殖作用。在 ECCM中加入 Phosphorimidon,不能使 ECCM的促增殖效应消失 (P<0 .0 5 )。ETA- OGN(15 μm ol/L)对无血清正常的 DMEM培养基培养的 VSMCs增殖没有显著影响 ,但显著抑制 ECCM和 ET- 1的促增殖作用 (P<0 .0 1vs ECCM)。结论 :ECs通过分泌包括 ET- 1在内的多种因子促进 VSMCs增殖 ,其中 ET- 1发挥主要的作用。

关于医学实习生人文素质教育的思考

面对21世纪社会发展和卫生保健系统出现的新困境，现代医学已经形成新的目标。要求正确认识人文素质的内涵，明确医学生应当具备的人文素质，以解决当前我国医学教育存在的注重专业知识、技能的传授而忽视人文素质教育的问题。本文着重从强化医学技术与人文关怀结合的专业教育、营造医学院校人文环境、加强社会实践锻炼等几个方面探索了医学实习生人文素质教育的途径，强调把人文素质教育融入医学教育体系的全过程，以培养高素质的医学人才。

Ⅰ型内皮素受体反义寡核苷酸抑制人血管平滑肌细胞增殖

目的 研究Ⅰ型内皮素 (ET -1)受体 (ETA)反义寡核苷酸 (ODN)对血管平滑肌细胞 (VSMCs)增殖的影响。方法 培养人桡动脉 (humanradialartery ,HRA)的VSMCs ,通过四唑盐 (MTT)比色实验测定细胞的增殖 ,进而分别采用放射受体结合分析法和放射免疫法检测ETA蛋白表达和ET -1自分泌的情况。结果 ETA -ODN显著抑制VSMCs增殖 ,而且具有浓度和时间依赖性。ETA -ODN( 15 μmol L)具有时间依赖抑制ETA表达。ETA -ODN( 15 μmol L)作用 2 4、48h ,VSMCs的上清液ET -1水平以及VSMCs平均ET -1分泌水平 ,较对照组均显著降低 (P <0 .0 5 )。作用 72h ,ET -1分泌上清液水平继续降低 (P <0 .0 5 ) ,但是VSMCs平均ET -1分泌水平不但没有降低 ,反而高于对照组水平 (P <0 .0 5 )。结论 ETA -ODN通过减弱ETA表达和调节ET -1的自分泌抑制HRA的VSMCs增殖 ,提示对临床上血管移植术后的再狭窄有防治作用。

绿色荧光蛋白报告基因转染示踪体内骨髓间充质干细胞的分化

目的用绿色荧光蛋白(GFP)标记技术,观察组织工程化骨中种子细胞的变化与转归。方法用腺病毒载体Adeno-XTM将GFP基因转染新西兰大白兔骨髓间充质干细胞(BMSCs),成骨诱导培养3周后将其接种于磷酸钙/纤维蛋白胶复合支架材料,构建成组织工程化骨,回植于供体兔皮下。术后4周,激光共聚焦显微镜下示踪观察GFP,测定碱性磷酸酶(ALP)活性,免疫组化检测Ⅰ型胶原、骨钙素(OCN)和HE染色观察组织结构。结果4周后,大体可见组织工程化新骨形成;组织学显示新生骨围绕材料孔隙生成,磷酸钙/纤维蛋白胶复合材料部分降解;ALP活性明显增高;Ⅰ型胶原、OCN免疫组化染色阳性;新生组织内见GFP标记细胞。结论组织工程化骨组织结构与松质骨小梁类似;新生组织表达GFP,证实组织工程化骨组织的形成来源于接种细胞。

三种手术方法治疗兔Perthes病股骨头的VEGF表达

[目的]采用3种不同的手术方法(髓芯减压、滑膜切除和自体松质骨移植)治疗Perthes病模型,通过观察并比较VGEF表达的变化对其治疗效果作评价。[方法]36只3个月龄新西兰大白兔随机平均分为A、B、C、D4组。手术切断左侧圆韧带和股骨头支持带血供,建立兔Perthes病模型。模型制作后2周对B、C、D组分别采用髓芯减压、滑膜切除、自体松质骨移植方法加以治疗。[结果]大体观察:A、B、C三组均在8周发现股骨头较健侧变小,部分标本可见塌陷。D组8周股骨头软骨下骨未见明显塌陷。组织学观察:A、B、C三组8周才可见到部分修复。D组4周即可见纤维肉芽组织增生,部分新骨形成。免疫组织化学:B、C组各时间点VEGF免疫反应性(immu-noreactivity,VEGF-IR)与A组无明显差异。D组各时间点增殖区与肥大区VEGF阳性细胞率高于其他各组,相比有统计学意义(P<0.05,α=0.05)。[结论]自体松质骨移植手术治疗Perthes病模型中,VEGF的表达明显高于其他两组,组织病理上也发现本组股骨头骺软骨较其他两手术治疗组修复明显。

hBMP-2基因修饰的组织工程化骨修复兔桡骨节段性缺损

目的利用免桡骨节段性骨缺损模型，比较评估hBMP-2基因修饰的组织工程化骨修复骨缺损的能力。方法利用腺病毒载体Adeno-X^TM将hBMP-2基因转染新西兰大白兔骨髓间充质干细胞（BMSCs），培养扩增3周后接种于磷酸钙／纤维蛋白胶复合支架材料，构建成基因修饰的组织工程化骨（A组）；将自体BMSCs培养扩增3周后接种于磷酸钙／纤维蛋白胶复合支架材料（B组）和单纯磷酸钙／纤维蛋白胶复合支架材料（c组）作为对照组，与A组同时回植于供体兔桡骨节段性骨缺损。另外骨缺损模型自行修复组（D组），作为空白对照。分别于术后4周、8周、12周行大体观察，X线摄影，99^m Tc-MDP SPECT和组织学检查并比较其骨愈合率。结果实验组（A、B、C组）骨缺损部位均有新骨生成，12周时，均能达到骨性愈合，而空白对照（D组）仍为纤维组织充填；A组成骨数量，成骨速度和骨愈合率均高于B、c组，而B、C组之间差异无统计学意义。结论hBMP-2基因修饰的组织工程化骨成骨能力强，骨愈合率高，是一种理想的骨移植材料。