重组腺病毒介导的转录因子Runx3在神经胶质瘤细胞中的表达及其亚细胞定位

目的:制备含有融合Flag标签的Runx3基因的复制缺陷型重组腺病毒,感染神经胶质细胞瘤U251,观察外源Runx3在细胞中的表达及亚细胞定位。方法:用PCR的方法扩增Runx3基因,并将Flag标签蛋白的编码基因与RUNX3基因进行融合,构建腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV-Runx3,经KpnI/XhoI双酶切鉴定并测序。利用电转化方法将经PmeI线性化的pShuttle-CMV-Runx3穿梭载体导入BJ5183重组细菌,获取重组腺病毒质粒Ad-Runx3,再将经PacI线性化的Ad-Runx3重组病毒骨架质粒转染293A包装细胞,包装并扩增病毒。利用该病毒感染神经胶质细胞瘤U251,用免疫印迹法观察外源Runx3在细胞中的表达,用间接免疫荧光法观察其在细胞内的定位。结果:构建并包装表达Runx3蛋白的重组腺病毒,用重组腺病毒感染U251细胞后,经免疫印迹和间接免疫荧光法检测,可见外源导入的Runx3蛋白在细胞核内的特异性定位。结论:成功制备了含有融合Flag标签的转录因子Runx3基因的重组腺病毒,感染U251细胞,在细胞中观察到该分子表达后定位于细胞核中,为研究Runx3在神经胶质瘤发生中的作用奠定了实验基础。

抑癌基因Fhit重组腺病毒的构建表达及其在结肠癌细胞中的生物学功能

目的:构建携带抑癌基因Fhit的重组腺病毒并通过其研究Fhit蛋白对结直肠癌细胞增殖能力的影响。方法:利用PCR方法从人胎肝文库中克隆Fhit基因片段,Fhit基因PCR产物连入T载体构建重组质粒pMD18T-Fhit。测序正确后,将基因片段导入ptrack-CMV穿梭质粒中,构建重组穿梭载体ptrack-CMV-Fhit。将经PmeⅠ单酶切线性化的ptrack-CMV-Fhit和骨架腺病毒质粒pAdEasy-1共转BJ5183大肠杆菌,使ptrack-CMV-Fhit和pAdEasy-1发生同源重组。经PacI酶切鉴定正确后,将重组腺病毒质粒转染293A细胞获得表达Fhit蛋白的重组腺病毒rAd-Fhit,将获得的重组腺病毒感染结肠癌细胞,采用蛋白印迹法检测外源Fhit蛋白的表达,并进一步观察其对细胞增殖能力的影响。结果:成功构建了携带有Fhit基因的重组腺病毒,且能够在结肠癌细胞中成功表达Fhit蛋白。在结肠癌细胞中,Fhit蛋白明显减弱了结肠癌细胞的增殖能力。结论:在结肠癌细胞中,Fhit基因可能扮演抑癌基因的角色,而表达Fhit的重组腺病毒很可能成为一种结肠癌生物治疗的新策略。

hNIS基因介导碘摄取测量microRNA let-7在肺腺癌A549细胞中的表达

目的拟建立用放射性核素测量microRNA（即miRNA）在肿瘤细胞中表达的新方法，探讨miRNA与肿瘤的关系。方法分别克隆人钠／碘同向转运体（hNIS）及可与let-7互补结合的ras基因的3′非翻译区（3′-UTR），即RU序列；以hNIS作为报告基因，将ras基因的3′-UTR与hNIS连接构建融合基因（hNIS—RU），使hNIS的表达受let-7的调控；同时克隆前体let-7（pri-let-7）及前体mir143（pri—mir143），转入细胞后加工形成成熟的let-7及mir143。将hNIS及hNIS—RU分别转染肺腺癌A549细胞，转染24h后，于培养液中分别加入37kBq^125I，1h后收集细胞并测量^125I计数；将hNIS-RU分别与不同量的pri-let-7或pri—mir143共转染A549细胞，转染细胞24h后分别测量其对Na^125I的摄取。结果转染hNIS的A549细胞^125I摄取明显增高，是未转染A549细胞的12倍；转染hNIS—RU的A549细胞^125I的摄取减低，为转染hNIS A549细胞的70％，是未转染A549细胞的8倍；hNIS—RU及pri—let-7共转染A549细胞的放射性计数进一步降低，为转染hNISA549细胞的50％；转染hNIS—RU不变，增加pri—let-7的转染量，^125I的摄取随pri—let-7的增加而降低；转染hNIS—RU不变，共转染不同浓度的pri-mir143，A549细胞对^125I的摄取基本不变。结论构建了hNIS—RU融合基因，hNIS在细胞中的表达受let-7的调节，二者呈反比关系。初步建立了以hNIS为报告基因测量miRNA在细胞中表达的高灵敏度放射性核素新方法。