差异显示反转录PCR技术研究进展

分析一对细胞或组织在不同状态下基因表达的差异,已成为分子生物学研究领域的热点之一.近年来,用于识别差异表达基因的方法已发展起来多种.DDRTPCR是近年来较为广泛应用的一种技术.理论上,DDRTPCR技术比较简单,但实施起来却存在着假阳性率高,凝胶中单条cDNA带成分不均一,所获cDNA仅代表着mRNA3′UT区(约300bp)以及一些低拷贝数mRNA不能有效被呈现等问题.对DDRTPCR技术的改良也主要集中在解决这些问题方面.

乙脑病毒核酸诊断方法的建立及应用

目的 建立一种新的乙脑病毒基因诊断方法 ,并进行大样本检测。方法 使用一步反转录巢式PCR进行乙脑患者血液及脑脊液的病毒核酸检测 ,并与 2 -巯基乙醇耐性试验进行对比检测。结果 2 16例乙脑就诊患者血清的PCR阳性率为 77.8% ,2 -ME阳性率为 4 5 .3 7% ,脑脊液的PCR阳性率为 93 .2 0 % ,2 -ME阳性率为 3 7.3 8% ,有显著性差异。对不同病程日乙脑患者的检测 ,在初期和极期早期PCR的阳性检测率高 ,在极期后期和恢复期 2 -ME的阳性检测率高。结论 PCR法为一种适合于乙脑早期特异性诊断的新型基因诊断技术。

甲基化特异性PCR检测FMR1和XIST基因甲基化实验方法的建立

建立一种快速、灵敏的检测脆性X智障基因(fragile X mental retardation,FMR1)、X染色体失活基因(Xchromosome inactivation,XIST)甲基化的方法.用亚硫酸氢钠和对苯二酚对基因组DNA进行脱氨基修饰.以修饰后的DNA为模板,用两套不同的引物对:1对甲基化特异性引物和1对非甲基化特异性引物扩增FMR1基因(CGG)n重复序列区、FMR1和XIST基因的启动子区.PCR产物进一步克隆、测序.以亚硫酸氢钠和对苯二酚脱氨基修饰后的DNA为模板进行PCR扩增后的产物与预期基因目的基因片段大小相符合,无非特异性扩增产物.测序结果表明,FMR1、XIST基因中的非甲基化的C碱基转变为U碱基,而CpG岛被甲基化的C碱基不改变.成功地建立了检测FMR1、XIST甲基化的方法,为实验室诊断脆性X综合征提供了新的方法.

TDI-FP技术检测耐乙胺丁醇结核分支杆菌embB306点突变

目的 应用TDI FP技术分析结核分支杆菌embB 30 6点突变与乙胺丁醇耐药性的关系 ,并建立一种准确、快速的诊断结核分支杆菌乙胺丁醇耐药的新方法。方法 对临床 82例耐多药结核病患者所感染的结核分支杆菌菌株进行常规培养和药敏实验 ;提取结核分支杆菌DNA ,并PCR扩增 2 0 5bp的embB基因片段 ,消化降解掉PCR产物中残余的dNTPs和引物 ,进行模板指导的荧光标记终止碱基掺入反应 ;应用Victor2测定反应产物的荧光偏振值 ,分析所有样品的embB基因 30 6位点的基因型 ;对分析结果进行测序验证。结果 5例乙胺丁醇高度耐药患者中有 3例所感染的结核分支杆菌发生embB 30 6的ATG→GTG突变 ;4 7例乙胺丁醇低度耐药患者中有 15例为embB 30 6突变和未突变的混合感染 ;30例乙胺丁醇敏感患者的结核分支杆菌未发现embB 30 6突变。测序结果与实验相符合。结论 embB 30 6突变与结核分支杆菌对乙胺丁醇产生耐药性密切有关 ;应用TDI FP技术可以准确、快速简便检测embB 30 6突变 ,在结核分支杆菌耐乙胺丁醇的临床诊断中具有潜在的应用前景。

应用滴金免疫法检测血清甲肝病毒IgM抗体

甲型病毒性肝炎是由甲型肝炎病毒(HAV)引起的急性传染病。目前临床广泛使用的病原学检测方法多为酶联免疫法(ELISA)检测甲肝病毒IgM抗体(抗-HAV-IgM),该方法具有较高的灵敏度和特异度,但检测时间相对较长,一般不适合单人份检测,操作相对复杂。我们应用的滴金免疫法(Dot Immunogold Filtration Assay,DIGFA)快速检测血清抗-HAV-IgM具有简便、快速、准确等优点。现报告如下。

丙型肝炎病毒核心蛋白基因序列变异分析

为了研究西安地区丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）基因组中Ｃ区基因的变异性，采用单链构象多态性（Ｓｉｎｇｌｅ－ＳｔｒａｎｄＣｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎＰｏｌｒｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＳＳＣＰ）分析万法，对３６份ＨＣＶＲＮＡ阳性血清的ＰＣＲ产物进行分析，结果有３１份样品的ＳＳＣＰ图谱相同，对其中二份样品进行测序，证明序列是相同的；另外５价样品ＳＳＣＰ图谱不相同，其序列与前者也有差异。说明本地区ＨＣＶ基因组中Ｃ区基因存在一个主要的基因类型。该实验为本地区ＨＣＶ诊断试剂和疫苗的研究确定了研究材料。

噬菌体展示随机肽克隆的一种快速、高通量测序技术

目的:探索应用焦磷酸微测序(Pyrosequencing)技术建立一种针对噬菌体展示随机肽的高通量序列测定方案。方法:环7肽噬菌体展示随机肽库的淘筛后随机挑选10个蓝色噬菌斑作为模板,PCR扩增随机7肽区序列,应用Pyrosequencing技术进行实时测序和分析。结果:应用Pyrosequencing技术对10例样品的随机7肽区进行序列分析,得到一个GXXXHPQ的同源基序(X为任意氨基酸),此基序为链亲合素的结合肽基序,结果与预期相符合。结论:Pyrosequencing技术具有操作简易快速、高通量的优点,必定可以广泛应用于各种随机肽库的筛选测序。

高通量apoE基因分型技术的建立及应用

目的建立一种准确、快速、高通量的apoE基因分型技术。方法从外周血样品提取基因组DNA,PCR扩增覆盖第112和158密码子的apoE基因片段;构建apoE基因片段重组质粒,并进行定点诱变,以得到3种等位基因型的对照样品;PCR产物消化处理,以除去残余的引物和dNTPs;进行模板指导的荧光染料标记终止碱基的掺入反应,应用荧光偏振检测仪分析荧光偏振值的变化;检测79例阿尔茨海默病(Alzheimer'sdisease,AD)患者和63名健康老年人的apoE基因型,分析基因型与AD易感性之间的关系。结果对分析结果进行测序验证,表明模板指导的荧光染料标记终止碱基掺入-荧光偏振检测技术分析结果与测序结果完全相符。AD组和健康对照组样品的基因分型结果提示apoEε4等位基因是迟发型AD的危险因素。结论应用此技术进行apoE基因多态性的基因分型分析,具有准确、简易和高通量等优势,可以作为AD风险分析的一种新技术,也适于apoE基因与其他疾病相关性研究时的大规模基因筛查分析。

用单表位合成肽抗原荧光偏振免疫法检测抗幽门螺旋杆菌尿素酶的抗体

目的:应用单表位合成肽抗原,建立一种新的基于荧光偏振技术(fluorescencepolarization,FP)的抗体检测方法。方法:用幽门螺旋杆菌(Helicobacterpylori,Hp)尿素酶B(UreB)的单表位合成分支肽抗原免疫小鼠,以ELISA法分析免疫的效果。分析FITC标记的合成肽抗原在不同浓度时的FP值,用FP技术分析抗原表位的抗原性以及不同稀释比例的血清样品对FP检测的影响。分别应用FPIA法和ELISA法,对126例样品进行Hp感染检测,对FPIA的检测数据进行受试者工作特征曲线(receiveroperatingcharacteristiccurve,ROC)分析。结果:UreB的单表位抗原肽具有较强的抗原性和免疫原性;1.0nmol/L的FITC标记肽可用于FPIA检测,血清样品做1∶25稀释时可明显区分阳性和阴性检测结果。与ELISA方法检测的结果相比较,用基于UreB单表位合成肽抗原的FPIA法检测Hp感染的灵敏度为85.7%,特异度为98%。结论:应用UreB单表位合成肽抗原,可对抗UreB的抗体进行快速FPIA检测,用此法检测抗体在疾病的临床诊断中具有广阔的应用前景。

人乳头瘤病毒相关抗体的检测及意义

人乳头瘤病毒感染与多种恶性肿瘤关系密切。分子生物学的进展使人乳头瘤病毒血清学检查成为检测现存或既往人乳头瘤病毒感染,以及预警其相关恶性肿瘤的重要流行病学手段。本文就人乳头瘤病毒相关的抗体反应与病毒DNA携带的关系、与宫颈癌等疾病的相关性,以及影响抗体反应的因素等方面作一综述。

利用荧光偏振技术检测耐异烟肼结核分枝杆菌KatG315点突变

目的 应用模板指导的荧光染料终止物掺入反应 荧光偏振检测技术 (template directeddye terminatorincorporationwithfluorescencepolarizationdetection ,TDI FP)分析结核分枝杆菌KatG 315点突变与异烟肼耐药性的关系 ,并建立一种准确、快速的诊断结核分枝杆菌异烟肼耐药性的新方法。方法 对临床 82例耐多药结核病患者所感染的结核分枝杆菌菌株进行常规培养和药敏实验 ;提取结核分枝杆菌DNA ,并经聚合酶链反应 (PCR)扩增 2 71bp的KatG基因片段 ,PCR产物经消化处理清除残余dNTPs和引物 ,进行TDI反应 ,应用Victor2测定荧光偏振值 ,分析所有样品的KatG基因 315位点的基因型。结果 2 9例异烟肼高度耐药患者的结核分枝杆菌中有 15例发生KatG 315的G→C突变 ,其中 4例为KatG 315突变和未突变的混合感染 ,突变率为 5 2 % ;32例异烟肼低度耐药患者的结核分枝杆菌中有 15例为KatG 315突变和未突变的混合感染 ,突变率为 4 7% ;2 1例异烟肼敏感患者的结核分枝杆菌未发现KatG 315突变。结论 KatG 315突变与结核分枝杆菌对异烟肼产生耐药性密切相关 ;应用TDI FP技术检测KatG 315突变具有准确、快速、简便以及高通量等优点 。

滴金免疫法快速检测肾综合征出血热血清特异性IgM的研究

目的建立一种快速、敏感、适于基层应用的检测肾综合征出血热患者血清特异性ＩｇＭ的方法。方法将汉坦病毒核蛋白点于硝酸纤维薄膜上，用来捕获血清标本中的肾综合征出血热病毒特异性ＩｇＭ，通过胶体金标记的抗人μ链单克隆抗体直接显色，阳性者出现红色斑点。结果整个试验过程仅需２～４分钟，操作简单。用该法与酶联免疫吸附试验对比检测４５份肾综合征出血热患者血清标本，两法均阳性为４１份，两法均阴性为２份，总符合率为９６％。结论滴金免疫法简便、快速，适于基层应用，可用于肾综合征出血热的早期诊断及流行病学研究。