高效表达肝癌相关抗原HAb18G的CHO细胞株的建立

目的 获得高效表达肝癌相关抗原 HAb18G的CHO细胞株。方法 构建含有肝癌相关抗原 HAb18G基因的真核表达载体并经限制性酶切及部分序列分析证明插入是否正确。用阳离子脂质体介导转染 CHO细胞经 G418筛选 ,稳定表达 ,间接免疫荧光染色证实蛋白表达情况。用有限稀释法将筛选的细胞进行单克隆化 ,通过流式细胞仪筛选高效表达株。结果 成功构建了真核表达载体 pc DNA- 3/HAb18G并经限制性酶切及部分序列分析证明基因插入正确。间接免疫荧光染色证实 :HAb18G高效表达于转染细胞的胞膜上。流式细胞仪筛选获得了 1株高效表达的 CHO细胞。结论 实验结果为

肝癌^(188)Re放射免疫治疗的实验研究

目的：研究新型核素188Re标记的抗人肝癌单抗片段HAb18 F（ab′）2对荷肝癌移植瘤裸鼠的抑瘤效应。方法：建立荷人肝癌移植瘤裸鼠模型。选择肿瘤体积为（30～150）mm3的动物随机分5组，其中3组分别尾静脉注射188Re－HAb18 F（ab′）2 3．7、11．1和18．5MBq，给药2次，观察动物体重和肿瘤体积变化。处死动物，摘取瘤体，石蜡包埋，进行HE染色。结果：3组剂量均有不同程度的抑瘤作用，且随着剂量的增加，抑瘤效应增加。低剂量组和中剂量组动物平均体重和生理盐水对照组相比无显著性差异(P＞0．05)。组织学检查表明，随着剂量的增加，肿瘤细胞核形态发生明显的变化，从凝固、核碎裂直至溶解。结论：188Re－HAb18 F（ab′）2是一种新型核素的肝癌导向治疗剂，具有潜在的临床应用前景，本文的研究可为其过渡到临床研究提供参考依据。

PMA诱导的THP-1细胞分化过程中MMP-9及MMP-2的表达与细胞侵蚀性的关系

目的: 应用单核细胞THP -1株建立单核细胞向巨噬细胞分化的体外模型, 并探讨THP- 1细胞分化过程中基质金属蛋白酶 9(MMP -9)及基质金属蛋白酶 2 (MMP -2)的表达与细胞侵蚀性的关系以及巨噬细胞在类风湿关节炎 (RA)发病机制中的作用。方法: 用乙酸肉豆蔻佛波酯 (PMA) 诱导THP- 1细胞向成熟的单核 巨噬细胞分化后, 采用倒置显微镜观察分化细胞的形态学变化。用流式细胞术测定细胞表面特异性抗原CD14的表达。采用明胶酶谱 (gelatin- zymogram)分析法测定分化前后THP- 1细胞中MMP -9和MMP- 2的表达。采用侵蚀性小室 (BoydenChamber -Matrigel人工重组基底膜 )法, 观察分化前后的THP- 1细胞侵蚀性的变化。结果: THP- 1细胞向单核 巨噬细胞分化过程中, 细胞由分散、悬浮转变为黏附、贴壁, 且出现CD14的高表达。分化后的THP- 1细胞中MMP -9和MMP- 2的表达明显增多, 侵蚀性明显增强。结论:建立了THP- 1单核细胞的体外分化模型。该细胞在分化过程中, MMP- 9和MMP -2的表达增多、侵蚀性增强, 为巨噬细胞在RA发病机制的作用提供了一定的实验依据。

钙依赖性磷脂结合蛋白Annexin Ⅱ的研究进展

AnnexinⅡ是Annexins超家族中A亚家族的重要成员,具有钙离子介导的磷脂结合特性.主要表达在人体内皮细胞、单核/巨噬细胞、骨髓细胞和某些肿瘤细胞中.本文着重就AnnexinⅡ的基因结构、蛋白结构、生物学功能及其与疾病的关系进行阐述.

^(188)ReHAb18F(ab′)_2肝癌放射免疫显像的研究

目的 探讨1 88Re标记的肝癌单抗片段HAb18F(ab′) 2 在荷人肝癌移植瘤裸鼠体内的放免显像和生物学分布。方法 采用 2 巯基乙醇为还原剂的直接法标记肝癌单抗片段HAb18F(ab′) 2 ,Whatman 3mm纸层析法测 1 88Re HAb18F(ab′) 2 标记率 ,活细胞放射免疫结合法测标记物的免疫活性。放免显像实验时 ,于荷肝癌裸鼠尾静脉注射标记物 11 1MBq ,SPECT低能通用型准直器显像。生物学分布实验中每只荷肝癌裸鼠尾静脉注射标记物 1 85～ 2 5 9MBq ,分别于注射后不同时间点各处死一组 ,取血及主要组织 ,称重 ,测放射性计数。结果 最佳标记率为 91 7% ,免疫活性分数为 0 78。低能通用型准直器可缓解1 88Re显像时边界模糊的问题。在显像观察中 ,3h时右下肢肿瘤区已有放射性聚集 ,19h～ 30h时肿瘤显影清晰、明确 ,45h以后整体放射性均趋于减弱。生物学分布表明 ,标记物除在肿瘤中有特异性聚集外 ,在其他正常组织中无特异性浓聚 ,尤其在血液中清除较快 ,肿瘤最佳显像时间可确定为 2 0～ 30h。结论 1 88Re HAb18F(ab′) 2 在荷人肝癌裸鼠体内可明确地定位于肿瘤部位 。

基于抗体等重组蛋白表达产品的哺乳动物细胞大规模发酵技术

抗体等重组蛋白产品是以基因工程和细胞工程为关键技术的生物技术产品，其特异性高、均一性好、靶点明确，广泛应用于各类重大疾病、尤其是对肿瘤治疗。目前，在FDA批准的32种抗体药物治疗疾病的分类中，肿瘤类疾病占32％、免疫性疾病占37％、器官移植疾病占11％、感染性疾病占8％、心血管疾病占4％、其他疾病占6％。

人肝癌细胞cDNA文库的构建及鉴定

AIM To construct human hepatocarcinoma cell cDNA library. METHODS Total RNA and purified mRNA were extracted from human hepatocarcinoma cell line HHCC. The single strand and double strand of cDNA were synthesized through reverse transcription. The cDNA fragments, smaller than 500 bp, were removed and the remaining cDNAs were connected with Eco RI adaptors and then combined with the right and left arms of dephophrylated λgt11 Eco RI. The recombinant cDNAs were packaged in vitro , and then a small portion of packaged phage was used to infect E.coli Y1090 for titration. RESULTS The HHCC cell line cDNA library consisting of 1.2×10 6 recombinant bacteriophages was constructed. The average exogenous insert of the recombinants was about 1.5 kb. CONCLUSION The constructed cDNA library can be used to screen target clones.

稳定表达肝癌相关抗原HAb18G/CD147成纤维细胞株的建立及其意义

目的 :探讨将HAb1 8G全长cDNA转染成纤维细胞NIH/ 3T3的可行性及其意义 .方法 :将含有肝癌相关抗原HAb1 8G全长cDNA的真核表达载体 pcDNA3.0 /HAb1 8G利用脂质体介导法转染小鼠成纤维细胞NIH/ 3T3,G4 1 8筛选建立稳定表达阳性克隆细胞株t3T3;利用流式细胞仪、间接免疫荧光染色方法鉴定目的蛋白转染情况 ;RT PCR琼脂糖电泳、明胶酶谱分别从mRNA和蛋白水平检测转染前后HAb1 8G刺激 3T3细胞分泌基质金属蛋白酶 (MMP 2、MMP 9)的情况 .结果 :利用脂质体介导法将HAb1 8G全长cDNA转染入成纤维细胞NIH/ 3T3,G4 1 8筛选 ,流式细胞仪分析、间接免疫荧光染色证实成功建立了稳定表达HAb1 8G的阳性克隆株 ;RT PCR琼脂糖电泳证实t3T3细胞MMP 2、MMP 9mRNA转录水平较未转染前增多 ;明胶酶谱表明t3T3分泌MMPs能力较未转染前增强 .结论 :HAb1 8G全长cDNA可以稳定转染成纤维细胞 ,并能从核酸和蛋白水平诱导基质金属蛋白酶高表达 。

βig-h_3基因的真核表达及其对人7721肝癌细胞基质金属蛋白酶表达水平的影响

目的:构建βig-h3基因真核表达载体pEGFP-C2/βig-h3并转染人7721肝癌细胞,检测转染后细胞MMPs表达水平的变化。方法:用RT-PCR方法获得βig-h3基因,以pEGFP-C2为载体,构建重组表达质粒pEGFP-C2/βig-h3。重组质粒用脂质体转染人7721肝癌细胞,明胶酶谱法检测转染后细胞MMPs表达水平的变化。结果:正确构建了pEGFP-C2/βig-h3重组质粒,并且在人7721肝癌细胞达到高转染效率,转染后细胞MMPs表达水平明显升高。结论:成功构建了pEGFP-C2/βig-h3真核表达质粒,βig-h3促进人7721肝癌细胞分泌MMPs,提示βig-h3与肝癌的侵袭和转移密切相关。

细胞亲环素A促单核细胞THP-1钙离子的运动及细胞黏附能力

目的观察细胞亲环素A(CypA)对单核细胞THP-1细胞胞内钙离子运动及细胞与细胞外基质黏附能力的影响。方法乙酸肉豆蔻佛波酯(PMA)诱导分化THP-1细胞,通过激光共聚焦及结晶紫染色法检测CypA刺激THP-1细胞后细胞内游离钙离子浓度的变化及细胞与细胞外基质黏附能力的变化,同时使用CsA、CD147分子拮抗剂AP-9作用细胞,观察CD147分子是否参与了CypA这一调节作用。结果CypA显著促进分化前及分化后的THP-1细胞胞内游离钙离子的运动,同时增强了细胞与细胞外基质的黏附能力(P<0.05),CsA、CD147分子拮抗剂AP-9则可以阻断CypA对细胞钙离子及黏附能力的调节作用。结论CypA通过CD147分子促进细胞钙离子的运动及细胞黏附能力,提示在类风湿关节炎(RA)中CypA可以增强单核/巨噬细胞与滑膜及软骨面的结合及侵袭能力,促进了关节炎的发生发展。

βig-h3在肝癌细胞系中差异表达的筛选和鉴定

目的:筛选并鉴定TGFβ诱导分子βig-h3基因在肝癌细胞系T7721和7721中的差异表达.方法:培养肝癌细胞系T7721(转染并稳定高表达HAb18G/CD147),7721(未转染HAb18G/CD147),提取总RNA,荧光交换标记(Cy5和Cy3)筛选信号转导相关基因芯片;RT-PCR检测基因芯片初步筛选出的差异分子(βig-h3)在肝癌细胞T7721和7721中的差异表达.结果:①经基因芯片差异分析,在高表达HAb18G/CD147的T7721细胞中TGFβ诱导分子βig-h3的mRNA表达明显上调,为7721细胞的4.4倍;而TGFβ1的mRNA表达无明显差别.②RT-PCR显示βig-h3mRNA在T7721中的表达水平明显高于7721(t=14.42,P<0.01).结论:经基因芯片筛选分析,发现HAb18G/CD147分子与TGFβ诱导分子βig-h3的表达成正相关,HAb18G/CD147的高表达诱导了βig-h3的表达增高,为进一步探讨在细胞内信号转导通路中HAb18G/CD147分子促进肝癌细胞侵袭和转移的作用机制奠定了基础.

降低mRNA翻译起始区的稳定性原核非融合表达HAb18GEF

为在大肠杆菌中非融合表达肝癌相关抗原HAb18G胞外区片段 (HAb18GEF) ,将HAb18GEF基因的cDNA插入原核表达载体pET2 1a +。通过计算机辅助设计 ,对重组的HAb18GEF pET2 1a +的mRNA翻译起始区 (TIR)的二级结构和密码子偏性同时进行预测。结果发现其存在稳定的茎环结构和许多稀有密码子。通过优化二级结构和优化密码子偏性二种策略分别来降低HAb18GEF pET2 1a +的mRNA翻译起始区 (TIR)的稳定性。在不改变氨基酸序列的前提下 ,利用密码子的简并性 ,通过非连续定点突变实现这两种优化。将突变前后的重组子经酶切鉴定和测序验证后 ,转化感受态JM10 9 DE3宿主菌后 ,随机挑菌 3 7℃下用IPTG诱导表达。SDS PAGE、间接ELISA、Westernblot和细胞分级分离法分析这些重组子的诱导表达情况。RNAdotblot对比分析优化前后目的基因mRNA的量。结果证明 ,成功地构建了HAb18GEF pET2 1a +及其二种优化突变体。仅优化TIR区二级结构或仅优化TIR区密码子偏性均能实现HAb18GEF蛋白的非融合表达 ,而未优化的重组子不表达任何HAb18GEF。非融合表达产物在大肠杆菌中主要以包涵体形式存在 ,高达 2 9 3 %。由于过表达和细胞渗漏 ,培养基和周质腔中也可检测到少许的HAb18GEF。优化二级结构和优化密码子偏性二种策略的HAb18GEF的非融合?

人源噬菌体Fab抗体库构建过程中引物的优化和初步鉴定

目的 优化设计一套引物 ,扩增全套人抗体Fd片段和L链基因 ,改善扩增效率 ,益于人源噬菌体抗体库的构建。方法 根据V BASE数据库提供的人抗体可变区胚系基因 ,在其家族分类基础上 ,根据FR1区 5’端保守序列重新分组 ,设计特异性的 5’端扩增引物。同时对设计引物的匹配情况进行分析 ,并应用PCR扩增和测序反应对其扩增效果进行鉴定。结果 Fd链 5’端扩增引物有 5条 ,κ轻链有 6条 5’端扩增引物 ,而λ轻链 5’和 3’扩增引物有 10条。分析表明 ,人抗体可变区胚系基因与 5’引物有较好的匹配率 ,数目较少 ,匹配率较高。PCR结果显示 ,全部的重链及轻链引物对均能高效扩增出特异性较高的目的片段。测序结果表明PCR扩增产物具有较好的亚类和可变区家族分布。结论 优化了一套扩增全套人抗体Fd片段和L基因的引物 。

血管内皮生长因子和血管生成与胃癌发展的关系

目的 :探讨血管内皮生长因子 (VEGF)和血管生成与胃癌发展的关系 .方法 :应用免疫组织化学方法 ,检测 10 2例人胃癌组织VEGF蛋白表达和微血管密度 (MVD) .分析VEGF和MVD及其与胃癌组织学分级、浸润深度、生长方式、淋巴结转移和预后的关系 .结果 :VEGF阳性表达率为4 9.1% ,VEGF阳性者MVD值显著高于阴性者 (P <0 .0 5 ) ,VEGF表达和MVD与胃癌淋巴结转移密切相关 (P <0 .0 5 ) ,而与组织学分级无关 ;VEGF表达还与胃癌浸润深度和生长方式密切相关 (P <0 .0 5 ) ;VEGF表达阳性或MVD≥ 5 0的胃癌患者 5a生存率较低 (P <0 .0 5 ) .结论 :VEGF与胃癌的血管生成密切相关 ,对胃癌的生长和浸润转移有促进作用 。

不同免疫方案制备抗HAb18G/CD147胞外区多克隆抗血清的比较

目的: 制备针对肝癌相关抗原HAb18G/CD147胞外区不同表位的抗血清, 比较不同免疫方案的免疫效果。方法: 以原核表达的GST -HAb18GEF融合蛋白、重组真核表达质粒pcDNA3 /HAb18G及HCC细胞为免疫原, 分别采用蛋白常规免疫、DNA肌肉免疫及pcDNA3 /HAb18G -HCCbooster(DNA -cellbooster)免疫接种BALB/c小鼠。采用间接ELISA和细胞ELISA, 同时测定免疫血清中抗变性和天然HAb18GEFIgG抗体的滴度和Ig亚类。用Westernblot检测各免疫方案制备的抗血清, 与变性HAb18GEF抗原结合的特异性。用免疫荧光法验证DNA- cellbooster免疫接种法制备的抗血清, 与细胞膜上天然HAb18G抗原的结合特异性。结果:以GST- HAb18GEF常规免疫后, 可诱导高滴度的IgG1抗体产生, 但针对的多为HAb18GEF的变性或线性表位; 以pcD -NA3 /HAb18G肌肉免疫后, 可诱导针对其天然表位的IgG2a抗体产生, 但滴度较低; 以DNA -cellbooster免疫后, 可诱导中等滴度、针对其天然表位的IgG2a和IgG1抗体产生。结论: 不同免疫方案可诱导针对HAb18GEF不同表位、不同滴度的多克隆抗血清, 为淘筛针对其不同表位的多样性抗体奠定了基础。

肝癌相关抗原HAb18G真核表达载体的构建及表达

目的在真核细胞中高效表达肝癌相关抗原HAb18G。方法构建含有肝癌相关抗原HAb18G基因的真核表达载体 ,并经限制性酶切及部分序列分析证明插入是否正确。用阳离子脂质体介导转染COS 7细胞和CHO细胞 ,并分别进行瞬时及稳定表达 ;通过间接免疫荧光染色和流式细胞仪检测蛋白的表达情况。结果成功地构建了真核表达载体 pcDNA 3/HAb18G ,并经限制性酶切及部分序列分析证明基因插入正确。间接免疫荧光染色证实 ,HAb18G高效表达于转染细胞的胞膜上。流式细胞仪分析显示 ,COS 7细胞的转染率约为7.5 % ,平均荧光强度为7.36 ,从CHO细胞获得的单个阳性克隆的平均荧光强度为2.17。结论以上结果为大量获得表达的HAb18G蛋白分子用于其生物学功能的研究奠定了基础。

肝癌相关抗原HAb18G胞外区片段的原核表达与免疫学活性分析

目的 :利用大肠杆菌高效表达肝癌相关抗原HAb18G胞外区片段 ,并分析其与相应抗体的结合活性 ,进而明确表达产物用于筛选基因工程抗体的可行性 .方法 :用PCR技术扩增出HAb18G胞外区基因片段 ,克隆入原核表达载体pGEX 4T 3中 ,筛选及鉴定阳性重组子 ,IPTGv诱导表达后对表达产物进行纯化及复性等处理 ,同时利用SDS PAGE ,Western Blot以及ELISA等方法检测蛋白表达情况及其免疫学特性 .结果 :成功构建了肝癌相关抗原HAb18G胞外区片段的原核表达载体 pGEX 4T 3/HAb18GE ,并在大肠杆菌中成功实现高效融合表达 .表达蛋白Mr 4 6 0 0 0 ,表达量约占菌体总蛋白量的 4 3% ,表达产物主要以包涵体形式为主 .另外 ,表达蛋白在变性和非变性的条件下均可以与HAb18GmAb特异性结合 .结论 :原核融合表达的HAb18G胞外区片段可以替代天然的HAb18G蛋白 ,以用做抗原来筛选新型的基因工程抗体 .

抗人肝癌基因工程嵌合抗体的构建及在Sp2/0细胞的稳定表达

目的 构建抗人肝癌嵌合抗体 ,并在Sp2 0细胞中进行稳定高效表达。方法 分别将HAb18轻、重链可变区基因克隆入真核表达载体pDHL构建重组载体pDHL chHAb18。酶切及测序鉴定后 ,转染Sp2 0细胞 ,经甲氨蝶蛉 (MTX)筛选获得抗性克隆。采用有限稀释法单克隆化后持续MTX加压培养。通过ELISA筛选高效表达的单克隆细胞株。表达产物纯化后 ,进行SDS PAGE和Westernblot检测 ,同时采用ELISA和免疫荧光法检测其抗原结合特异性。结果 成功构建了重组嵌合IgG抗体chHAb18的真核表达载体pDHL chHAb18。转化Sp2 0细胞后 ,初步筛选得到了高效表达chHAb18的细胞株。经MTX加压培养 ,1株细胞的chHAb18表达量达到 10mg L。SDS PAGE和Westernblot检测结果表明 :目的蛋白分子质量约为 16 0× 10 3,还原后为 2条带 ,分子质量约为 5 2× 10 3和 2 7× 10 3。上述蛋白条带均与羊抗人IgG抗体特异结合。结论 成功构建了抗人肝癌基因工程嵌合抗体chHAb18,并在骨髓瘤细胞中获得高效表达。为其进一步的应用研究奠定了基础。

用导向选择链更替技术建立抗肝癌抗原HAb18G的人源性Fab基因库

目的 :在嵌合HAb18 Fab抗体的基础上 ,利用载体pComb3X ,采用导向选择链更替技术建立全人源性Fab基因库。方法 :用RT PCR自肝癌患者外周血单个核细胞 (PBMC)中 ,扩增全套人抗体Fd基因片段和L链基因。首先 ,将Fd基因克隆入已含嵌合L链基因的展示载体pComb3X/CL中 ,建立人 -鼠杂合的Fab基因库 ,以原核表达的非融合HAb18G的胞外区片段为抗原 ,筛选杂合的Fab基因 ,以得到人Fd基因。然后应用筛选出的Fd基因与人L链基因库配对 ,建立全为人Fab的基因库 ,并筛选全人Fab基因。将IPTG诱导的表达菌裂解 ,取其上清对pⅢ Fab融合蛋白的功能进行分析 ,并对其编码基因进行测序。结果 :建立了库容为 2× 10 7的杂合Fab基因库 ,经 6轮筛选后得到 7株杂合Fab基因。利用筛选的人Fd基因建立了库容为 0 .8× 10 7的全人Fab基因库 ,经 4轮筛选得到 2株亲和力较高、特异性强的人Fab基因。测序结果显示 ,2株Fab基因具有相同的Fd基因序列 ,与亲本抗体同属IgG2亚类 ;L链基因为κ型 ,可变区均属于Vκ3家族。结论 :利用导向选择链更替技术 ,筛选出特异性较强、完全人源化的抗肝癌抗原HAb18G的Fab抗体 ,为进一步的工作打下了基础。