医学微生物学教学方法探讨

医学微生物学是一门医学生必修的重要桥梁课程,教学内容多,知识点杂,信息量大,容易混淆,教学过程中如果不注意灵活使用教学方法,往往难以引起学生的兴趣,教学效果不佳。教学过程中,教师主动结合教学内容选择适当的教学方法,可激发学生的学习兴趣,增加其学习自觉性。通过融入临床和人文知识教育,可以增加学生的感性认识,促进基础理论与临床实践的融合,提高解决实际问题的能力,改善教学效果。

从HIV讲授探讨医学微生物学教学改革

在医学微生物学教学过程中,灵活运用案例式教学法、以问题为中心的教学法、计算机辅助教学法及课外科研、课外科普活动等方法来提高教学效果,激发学生学习兴趣,培养学生发现问题、分析问题及解决问题的能力。

从微生物学教学探讨生物技术专业教学改革

对生物技术专业学员进行微生物学课程教学过程中,通过引进最新进展、融入分支学科内容、鼓励学员实践、引导学员讨论及开展课外科研和科普活动等方法,提高课堂教学效果,培养学生学以致用的能力。

结核分枝杆菌Ag85B-ESAT-6融合蛋白重组耻垢分枝杆菌对小鼠的免疫原性研究

目的评价表达Mtb Ag85B-ESAT-6融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌(Ag85B-ESAT-6-rM.s)在小鼠中的免疫原性。方法6周龄BALB/c小鼠经背部皮下注射1×106 CFU(colony-forming unit,菌落形成单位)的Ag85B-ESAT-6-rM.s,同时设M.s免疫组(10只)、BCG免疫组(10只)、Ag85B-ESAT-6融合蛋白免疫组(10只)和生理盐水组(10只)。接种免疫后1～6周,尾静脉采血,检测小鼠外周血CD4+和CD8+T细胞所占百分比;免疫后6周,MTS[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium,innersalt]法检测小鼠脾淋巴细胞增殖和酶联免疫斑点检测(enzyme-linked immunospot assay,ELISPOT)检测脾淋巴细胞分泌γ干扰素(interferonγ,IFN-γ)、白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)和白细胞介素-4(interleukin-4,IL-4)等细胞因子的水平。结果Ag85B-ESAT-6-rM.s免疫小鼠后能够明显刺激小鼠外周血CD4+和CD8+T细胞的产生,其所占百分比[(59.6±1.5)%]明显高于BCG免疫组[(48.8±2.3)%](t=12.252,P<0.05)和原始M.s免疫组[(45.7±1.6)%](t=20.166,P<0.05)。Ag85B-ESAT-6-rM.s免疫小鼠的脾淋巴细胞增殖指数(3.23±0.31)与BCG免疫刺激的增殖指数(2.95±0.36)相当(t=1.864,P>0.05),但其诱生IFN-γ的能力[斑点形成细胞(spotforming cells,SFC)][(167.5±36.6)SFC/106]明显高于BCG[(98.5±26.9)SFC/106](t=4.804,P<0.05)。结论Ag85B-ESAT-6融合蛋白在耻垢分枝杆菌中的表达能够明显提高M.s的免疫原性,并能够刺激小鼠机体产生有利于抗Mtb感染的免疫反应,作为TB新型候选疫苗具有一定的研究前景。

DNA疫苗及其免疫途径的研究进展

DNA疫苗（DNA vaccine）又称为核酸疫苗、基因疫苗,是指将含有编码某种抗原蛋白基因序列的质粒载体作为疫苗,采用某种方法直接导入动物细胞内,然后通过宿主细胞的转录翻译系统合成抗原蛋白,诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答,从而使被接种动物获得相应的免疫保护,

医学寄生虫学教学中的直观教学法探讨

直观教学法以其生动、形象、易于被学生接受的优势被越来越广泛地应用到教学实践活动中。随着教学改革的实施,在医学寄生虫学教学中运用多种直观教学手段,可以激发学生的学习兴趣,加强对理论知识的理解,使教与学更具有积极性和主动性。

表达结核分枝杆菌休眠相关抗原Rv2031c-Rv2626c融合蛋白重组耻垢分枝杆菌的构建与鉴定

利用大肠埃希菌—分枝杆菌穿梭表达载体pDE22,构建能够表达结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)休眠相关抗原Rv2031c-Rv2626c融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis,M.s)。采用聚合酶链反应(PCR)方法,从MTB H37Rv基因组DNA中扩增MTB休眠相关抗原Rv2031c和Rv2626c基因片段并克隆入pMD18-T载体。序列测定正确后分别亚克隆入大肠埃希菌—分枝杆菌穿梭表达载体pDE22。将重组载体pDE22-Rv2031c-Rv2626c电穿孔导入M.s,42℃热诱导表达目的蛋白,并进行SDS-PAGE和Western-blot分析。利用PCR方法扩增获得MTB休眠相关抗原Rv2031c和Rv2626c基因片段,大小分别为435 bp和480 bp。基因测序与Genebank公布的基因序列完全一致。SDS-PAGE分析结果表明重组载体pDE22-Rv2031c-Rv2626c电穿导入M.s后能够特异性表达目的蛋白,大小约为35 kDa,与理论值相符。Western-blot鉴定结果表明抗Rv2031c和抗Rv2626c的单克隆抗体均能够与目的蛋白发生特异性的反应,大小相一致。成功构建表达MTB休眠相关抗原Rv2031c-Rv2626c融合蛋白的重组M.s,并命名为Rv2031c-Rv2626c-rM.s,为其用于结核新型疫苗的研究奠定了基础。

汉坦病毒G1S0.7嵌合基因真核载体的构建及表达

构建含汉坦病毒嵌合基因G1S0.7的真核重组质粒,并在真核细胞中有效表达。从本室前期构建并经测序的重组质粒pShuttle—G1S0.7上双酶切回收得到片段G1S0.7后,克隆入真核表达载体pVAX,并将其通过脂质体介导转染HEK293细胞,表达产物用ELISA和Western—blot进行鉴定。酶切鉴定结果表明,成功构建了含汉坦病毒嵌合基因G1S0.7的重组质粒pVAX—G1S0.7;ELISA检测结果和Western—blot结果显示,汉坦病毒G1S0.7嵌合基因在HEK293细胞中得到了表达,所表达的融合蛋白分子量约90kD,与预期大小一致,并且表达产物可与抗汉坦病毒NPmAb特异性结合。说明所构建的表达载体可在真核细胞中表达出与汉坦病毒抗体有特异性结合活性的融合蛋白,为下一步基因免疫及进一步筛选HFRS基因疫苗候选组分提供实验依据。

小鼠结核分枝杆菌耐药模型的建立与评价

目的建立小鼠结核分枝杆菌耐利福平株静脉感染小鼠模型。方法 30只BALB/c雌性小鼠经尾静脉感染结核分枝杆菌耐利福平株每只106CFU,观察小鼠一般状况,并分别在感染后6周、10周、14周处死小鼠,进行脾、肺组织病理切片、抗酸染色、计脏器荷菌数。结果感染后小鼠体重呈逐渐上升趋势,脏器病理变化随时间推移由急性炎症逐渐转为慢性炎症反应,抗酸染色均为阳性,脏器荷菌数与感染剂量相对应,并至少可持续14周。结论成功建立了小鼠结核分枝杆菌耐利福平株静脉感染动物模型,为其进一步用于结核病防治研究奠定了一定的基础。

恶性疟原虫复合多表位基因的原核表达和多克隆抗体制备

原核表达恶性疟原虫多期多表位基因并制备其多克隆抗体。在前期构建恶性疟原虫复合多期多表位重组真核表达载体的基础上,将测序正确的AMAMEG基因克隆入原核表达载体pGEX4T—1并诱导表达。采用包涵体洗涤的方式纯化目的蛋白,以AMA—1抗体对纯化蛋白进行Western—blot分析。将纯化的融合蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体。通过PCR成功获得长度为1 000 bp的恶性疟原虫AMA—1胞外域基因片段,获得了与多表位基因连接后的AMAMEG基因。通过诱导表达,显示在相对分子量约95 000处有预计大小的特异性条带,表明成功表达出融合蛋白。经此纯化的融合蛋白免疫的小鼠能产生特异性抗体,其滴度达到1∶105。纯化的融合蛋白和多克隆抗体为研究新型疟疾疫苗奠定一定的理论和实践基础。

如何提高医学寄生虫学教学效果的探讨

医学寄生虫学课程是衔接基础医学与临床医学间的桥梁学科。针对当前学时压缩、学生缺乏学习兴趣的现状,努力从重视绪论的讲授,激发学生学习兴趣;掌握学科发展现状和动向,及时调整教学内容,适时引入前沿成果;改进教学方法,加强病例引导式教学法三个方面提高该课程的教学效果。

PbTIP多克隆抗体对恶性疟原虫生长抑制作用的初步研究

首先构建了伯氏疟原虫TIP样蛋白(以下简称PbTIP)的原核表达载体pET32a/PbTIP,在大肠杆菌中成功诱导表达了带His标签的PbTIP融合蛋白。SDS-PAGE分析显示该融合蛋白主要以包涵体形式表达。Western-Blot鉴定虽然证明该融合蛋白表达正确,但即便在变性条件下该蛋白的亲和层析纯化效果也不佳。以PbTIP融合蛋白经过初次和三次加强免疫获得的小鼠PbTIP多克隆抗体滴度达到1∶105以上。进一步的研究表明,小鼠PbTIP抗血清对体外培养恶性疟原虫的生长具有一定的抑制作用,这显示PbTIP多克隆抗体对恶性疟原虫感染具有一定的交叉保护作用。以上实验结果为后续PbTIP在疟原虫免疫抑制中的功能及其机制研究奠定了一定的基础。

结核分枝杆菌休眠相关抗原Rv1733c DNA疫苗的构建及免疫学特性研究

目的构建结核分枝杆菌(Mtb)休眠相关抗原Rv1733c的真核表达载体,并评价其作为DNA疫苗的免疫学特性。方法利用限制性酶切的方法从本室前期保存的pMD-18T-Rv1733c质粒中构建Rv1733c的真核表达载体pcDNA-Rv1733c。将pcDNA-Rv1733c重组质粒稳定转染P815细胞,并用间接免疫荧光法检测Rv1733c的表达。采用数字表法随机将BALB/c小鼠分为3组,每组10只,即pcDNA-Rv1733c质粒DNA组、生理盐水组和BCG组。pcDNA-Rv1733c质粒DNA组和生理盐水组采用肌内注射方式免疫,间隔2周免疫1次,共免疫3次。BCG组采用皮下免疫一次。各组小鼠每2周采血,ELISA检测血清中特异性抗体水平和IgG2a/IgG1抗体亚类比率与比值。初次免疫8周后,MTS[3-(4,5-diethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2Hetrazolium,inner salt](四氮唑蓝盐化合物)法检测小鼠脾淋巴细胞特异性增殖、ELISPOT检测脾淋巴细胞分泌IFN-γ的水平。流式细胞法检测脾淋巴细胞中CD4+和CD8+T细胞所占比率;LDH法检测CTL(cytotoxic T lymphocytes;细胞毒性T淋巴细胞)活性。结果成功构建Rv1733c的真核表达载体pcDNA-Rv1733c。间接免疫荧光实验表明pcDNA-Rv1733c质粒稳定转染的P815细胞中能够稳定表达Rv1733c蛋白。pcDNA-Rv1733c质粒DNA免疫小鼠后能诱导小鼠产生特异性抗体,抗体亚类以IgG2a为主,随着免疫时间的延长,IgG2a/IgG1的比值趋于平衡;脾淋巴细胞增殖指数(2.00±0.36)高于BCG组(1.1±0.06)(t=3.096,P<0.05);特异性分泌IFN-γ的脾淋巴细胞频数(41.48±5.30)SFC/106高于生理盐水组(2.75±1.37)SFC/106(t=4.752,P<0.05);然而脾淋巴细胞中CD4+、CD8+T细胞所占比率[分别为(18.15±2.30)%、(7.68±1.34)%]、CTL杀伤活性[(29.52±1.96)%]都与生理盐水组相当[(16.43±2.02)%(t=0.571,P>0.05)、(7.32±0.42)%(t=0.234,P>0.05)、(25.28±2.51)%(t=0.726,P>0.05)]。结论成功构建Rv1733c真核表达载体pcDNA-Rv1733c;并能够诱导小鼠机体产生特异性的体液和细胞免疫应答,提示用于结核病新型疫苗的研究具有一定的意义。

大麻素受体CB2在机械牵张力介导的人牙周膜细胞成骨分化中的作用

目的:研究大麻素Ⅱ型受体(cannabinoi dreceptor Ⅱ,CB2)在机械牵张力介导的人牙周膜细胞中的表达以及成骨分化中的作用。方法:体外培养人牙周膜细胞,构建细胞-机械牵张力加载模型,施加不同大小的机械牵张力,采用Real-timePCR和细胞免疫荧光化学技术检测CB2在人牙周膜细胞中mRNA和蛋白的表达。用碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测机械牵张力介导的细胞ALP活性。结果:对人牙周膜细胞施加不同大小的机械牵张力24h,CB2 mRNA的表达随机械牵张力的力值增大而显著性增加(P<0.05),在18%拉伸应变率作用下表达量最高(P<0.05),此时CB2蛋白的表达显著增加。加入CB2激动剂HU-308后,施加18%拉伸应变率的机械牵张力作用于人牙周膜细胞24h,ALP活性显著性增加(P<0.05)。结论:CB2在人牙周膜细胞中的表达与机械牵张力的力值具有相关性。在机械牵张力作用下,大麻素受体CB2与其配体结合能够促进人牙周膜细胞的成骨分化,从而在正畸牙槽骨改建中发挥重要作用。

结核分枝杆菌持续感染小鼠模型的建立及其免疫特征

为建立小鼠结核分枝杆菌持续感染模型并研究其免疫应答特征,选取雌性C57BL/6小鼠,经尾静脉感染结核分枝杆菌H37Rv株,并以异烟肼和利福平联合治疗。分别于感染后4、8、12周处死小鼠,用平板法计数肺和脾荷菌数,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清中特异性抗体水平及亚类,流式细胞术检测CD4+脾淋巴细胞经结核分枝杆菌抗原——纯化蛋白衍生物(PPD)刺激后分泌细胞因子的细胞比例。结果显示,感染4周后小鼠肺和脾荷菌数lg CFU分别达3.67±0.25和3.54±0.24,至少持续8周;药物治疗可有效降低脏器荷菌数。感染12周后,感染组血清中抗结核分枝杆菌特异性抗体水平显著升高(P<0.01),且以IgG1为主;治疗组总IgG抗体水平显著低于感染组(P<0.01),且IgG2a相对较高(P<0.05)。感染组CD4+脾淋巴细胞中γ干扰素(IFN-γ)和白细胞介素2(IL-2)分泌细胞比例显著增加(P<0.01和P<0.001),而IL-4分泌细胞比例显著降低(P<0.01);治疗组IL-2和IL-4分泌细胞比例显著低于正常组(P<0.05和P<0.01)。本研究建立的小鼠结核分枝杆菌持续感染模型有望用于结核病治疗性疫苗和药物的研发及筛选。

P.f多期多表位基因真核表达载体的构建和免疫学特性初步研究

目的构建恶性疟原虫多期多表位基因的真核表达载体及其免疫学特性的研究。方法在前期研究基础上,将测序正确的恶性疟原虫多期多表位基因克隆入真核表达载体VR1020内并大量制备。以VR1020重组质粒免疫HHD-2小鼠并进行细胞和体液免疫分析。结果成功获得重组真核表达载体,ELISA显示该重组质粒免疫小鼠后获得了较高效价的抗体,而且显示了较好的CTL杀伤活性,同时诱导了高水平的细胞因子。结论本研究为新型疟疾疫苗的研制奠定一定的理论和实践基础。

汉滩病毒包膜糖蛋白糖基化位点突变体重组假病毒的构建及初步鉴定

目的:为进一步研究汉坦病毒包膜糖蛋白的糖基化与病毒的感染性和免疫原性等的关系,构建含有汉滩病毒(HTNV)囊膜糖蛋白(GP)糖基化位点突变体的重组假病毒。方法:利用定点突变的方法,分别突变了HTNV 76-118株的5个N-糖基化位点并克隆入慢病毒表达载体,与包装质粒共转染293T细胞,构建5株重组假病毒。感染HEK293细胞后,进行RT-PCR鉴定及免疫荧光检测。结果:经测序显示构建的含有N-糖基化位点突变体的5个重组假病毒原序列中的天冬酰胺(N)均被置换为谷氨酰胺(Q)。RT-PCR结果显示5个重组假病毒均有HTNV GP基因的表达。免疫荧光检测5个重组假病毒均可表达HTNV的Gn和Gc蛋白。结论:成功构建了含有HTNV包膜糖蛋白糖基化位点突变体的5个重组假病毒,分别命名为rLV-M1、rLV-M2、rLV-M3、rLV-M4和rLV-M5。本研究为明确N-糖基化对汉坦病毒生物学活性的影响提供了有利的研究工具,并为汉坦病毒疫苗及致病机理的进一步研究打下了一定的基础。

巨噬细胞TLR2介导的老年人抗结核免疫研究进展

巨噬细胞是重要的固有免疫细胞，也是结核分枝杆菌侵犯的主要靶细胞。巨噬细胞可表达多种Toll样受体，其中TLR2是巨噬细胞识别结核分枝杆菌的结构成分，激活TLR2信号通路可以启动细胞内信号转导，诱导特异性基因表达，分泌细胞因子从而发挥效应。老年人免疫功能衰退，巨噬细胞的功能也发生了改变。本文就巨噬细胞TLR2介导的老年人抗结核免疫的相关研究进展进行综述。

汉坦病毒感染BALB／c小鼠组织中特异性抗原及病毒RNA的检测

目的检测汉坦病毒感染BALB／c小鼠组织中特异性抗原及病毒RNA，建立汉坦病毒感染动物的评价体系。方法将1000LD50的汉坦病毒悬液经肌肉注射感染BALB／c小鼠，在感染后的第3天，分别取小鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑等组织研磨后制成病毒悬液，以ELISA法和qRT—PCR法分别检测各组织中的汉坦病毒特异性抗原及病毒RNA。结果BALB／c小鼠感染汉坦病毒后短期内在脑和肝组织中可以检测到大量汉坦病毒特异性抗原以及病毒RNA，而心、脾、肺、肾组织中未检测到特异性抗原及病毒RNA。结论实验结果为建立汉坦病毒感染动物模型的评价体系提供了参考依据。

浅议标本在《医学寄生虫学》实验课教学中的重要性

面对目前《医学寄生虫学》教育的现状,充分利用现有教学手段和资源,积极建立、完善、维护标本库,引导学生有目的地参观,在完善实验课的内容和激发学生的学习兴趣上起到了积极的作用。