生物化学的教与学

在医学院校中,生物化学被认为是一门最难学的学科.传统的观念认为学习是一件"非常辛苦"的事情,从这种观念出发,导致我们的教学方式完全成为一种强迫性的任务,教师辛苦,学生辛苦.由于突出了这种"苦"字,而将学习的乐趣掩盖起来了.实际上教和学并非是一件很辛苦的事,本文试图分析在生物化学"教与学"中,从"寓教于乐"和"晓之以理"方面,浅谈几点教学体会.

基因重组人骨形成蛋白-2对培养骨髓细胞的生物学效应

目的：骨髓是机体重要的造血器官，其中的单个核细胞主要是单核细胞和巨噬细胞，骨髓组织在骨损伤修复过程中也发挥重要的作用．为提高骨形成蛋白（BMP）修复骨缺损的能力，方法：本实验观察了基因重组人骨形成蛋白-2（re－combinanthumanBoneMorphogeneticProtein－2，rhBMP2）对培养骨髓细胞生物学活性的影响．结果：低浓度的rhBMP2（＜0．16mg／L）对培养骨髓细胞的碱性磷酸酶活性、蛋白质含量均有明显的促进作用，且呈剂量依赖性，高浓度的rhBMP2（＞0．16mg／L）对培养骨髓细胞的增殖也有一定促进作用结论：本研究的结果进一步证实，骨髓细胞也是BMP重要的靶细胞，BMP不仅促进骨髓细胞向成骨细胞的表型转化，而且可以促进骨髓细胞的增殖，因此在使用复合BMP的植骨材料进行骨缺损修复时，如能辅以骨髓细胞植入，将会大大提高骨缺损的修复效果．

重叠重复人心钠素基因的化学合成及其克隆

根据人心钠素的氨基酸序列,借助于计算机,设计了8个寡核苷酸片段,并在DNA自动合成仪上合成了这些片段。经5′磷酸化、退火、连接等操作,这些片段组装成由两个心钠素基因首尾以终止起始码TGATG相连的串联体。将它插入质粒pRC_(23)转化E.coli TAP_(106)后,获得pY X_(40)对重组子的酶切图谱、原位杂交及DNA序列的分析表明,插入基因的方向、读框正确。

金属螯合四肽的化学合成及单克隆抗体的制备

目的：为了合成金属螯合四肽并制备其单克隆抗体。方法：从初始原料起，采用液相接肽等方法，合成三乙撑四胺钴（Ⅲ）－Ｎ－（α－羧基－苯乙基）－β－Ａｌａ－Ｐｈｅ－β－Ａｌａ－ＧｌｙＯＨ半抗原，并将其偶联到载体蛋白ＢＳＡ上制成抗原，免疫小鼠，采用杂交瘤方法制备单克隆抗体；结果：成功地合成了该金属螯合四肽，获得了８株单克隆抗体杂交瘤细胞系，并对这８株ＭｃＡｂ类与亚类等特性进行了鉴定，结论：可根据需要化学合成一些分子量很小的肽，并制备其单克隆抗体。

人表皮生长因子基因化学及酶促合成与克隆

作者利用DNA自动合成仪及酶促反应合成了全长175bp的人表皮生长因子基因,由计算机辅助进行基因序列、化学合成片段和酶切位点的设计,片段退火预测以及重复顺序和发夹结构的搜寻,所设计的基因具有多种克隆及表达途径。全基因先由DNA合成仪合成8个片段,经5端磷酸化及退火,再由DNA聚合酶合成4个缺口片段,用连接酶连接而形成,将基因插入pUC12质粒,转化JM103大肠杆菌,20ng的连接质粒转化后,在含X-gal及氨苄青霉索的营养琼脂平板上获得约200个白色克隆。随机选择7个克隆提取质粒作限制性内切酶鉴定,4个符合实验设计,取1个克隆作插入基因的DNA序列分析,结果与设计完全相符。

光生物素标记抗体用于人心钠素基因表达的检测

光生物素与兔抗鼠IgG以不同克分子比在可见光照射下进行标记。标记抗体用于抗原的检测,敏感度可达62.5pg/2μl。用同样方法对大肠杆菌TAP106(pYX40)中心钠素的表达进行了检测,与(125)~Ⅰ标记的兔抗鼠IgG得到一致的结果。

显示切割bcl－2mRNA的核酶在HL－60细胞内表达的免疫组织化学和原位杂交双染色法

显示切割ｂｃｌ－２ｍＲＮＡ的核酶在ＨＬ－６０细胞内表达的免疫组织化学和原位杂交双染色法王剑波，赵永同，王伯（第四军医大学病理学教研室西安７１００３３第四军医大学生物化学教研室）关键词凋亡；核酸；原位杂交；免疫组织化学中图号Ｒ４４６．６２核酶（ｒｉｂｏ...

艾滋病毒-env26肽基因的化学合成及克隆

选用HTLV-Ⅲ前病毒核酸序列中的6333—6410作为合成HIV-env26肽结构基因,加上必要序列及接头共104bp,分成8个寡核苷酸片段,使结构基因能自身连接成多重串联体。用DNA合成仪合成。组装后与高效表达质粒pRC23重组,转化TAP106。经筛选、鉴定及DNA序列分析,得到一株含有HIV-env26肽基因4重串联体的重组菌,命名为pXY104。

微生物表面呈现技术及应用

微生物表面呈现技术以其广泛的应用前景 ,日益引起关注 .

自由基与细胞凋亡

细胞凋亡是指细胞在生理和病理情况下的一种死亡模式，广泛涉及到肿瘤、衰老和退行性病变等一系列疾病．最近有实验表明自由基与细胞凋亡有密切的关系．

紫杉醇诱导食管癌细胞的细胞周期阻断与细胞凋亡

目的研究紫杉醇对食管癌细胞的细胞周期阻断及诱导凋亡的作用。方法应用形态学观察、琼脂糖凝胶电泳、流式细胞术等方法对紫杉醇诱导的食管癌细胞系Eca109进行了检测和观察。结果紫杉醇可将食管癌细胞阻断于G0／G1期及G2／M期并诱导其凋亡，凋亡细胞具有典型的凋亡形态特征，流式细胞仪检测有凋亡峰出现，琼脂糖凝胶电泳显示3nmol·L-1紫杉醇作用72h便可见明显的DNA梯带。100nmol·L-1和1000nmol·L-1浓度的紫杉醇作用于细胞，在形态变化与细胞周期变化上有很大差别。紫杉醇作用短时间（＜2h）去除后再培养比持续性作用更早促使细胞凋亡。结论紫杉醇不仅可以阻断食管癌细胞的分裂，而且对于间期细胞也有很大作用。细胞周期阻断并不直接诱导细胞凋亡，甚至可能抑制细胞凋亡的进程。食管癌细胞中存在多条凋亡途径。

携载rhBMP-2微球的新型可注射自凝固复合人工骨的制备及特性研究

[目的]制备一种具有良好降解性和成骨活性、可注射的自凝固新型骨修复材料。[方法]制备携载rh-BMP-2的聚乳酸与聚乙醇酸共聚物(PLGA)微球,并将其与rhBMP-2/磷酸钙骨水泥(CPC)复合,制备出rhBMP-2/PLGA微球/CPC复合人工骨。探讨了材料的特性,包括形貌、固化时间、抗压强度及反映材料体外降解速度的指标—体外降解液Ca、P浓度变化,测定复合材料rhBMP-2的释药速度及体外诱导MSCs细胞成骨分化的能力。[结果]与单纯CPC-rhBMP-2相比,复合材料的固化时间少量增加,抗压强度下降明显。体外降解速度及体外释药明显提高,释放的rhBMP-2具有骨诱导活性。[结论]rhBMP-2/PLGA微球/磷酸钙骨水泥新型复合人工骨是具有良好应用前景的骨修复材料。

一株人源性抗HBsAg抗体Fab片段的筛选及序列分析

一株人源性抗ＨＢｓＡｇ抗体Ｆａｂ片段的筛选及序列分析高辉高磊纪宗玲路凡陈南春陈苏民余宙耀张宜俊尤玉琴粟宽源（第四军医大学生物化学教研室，西安７１００３１空军广州医院全军肝病中心）乙型肝炎是我国常见的传染性疾病，目前尚无特效的治疗手段。研究发...

基因功能的研究方法

人类基因组计划的顺利进行使基因功能研究成为生命科学领域中的重大课题 ,基因转导、反义技术、转基因和基因剔除、染色体转导、RNA干涉等是目前研究基因功能的主要方法 ,新的技术不断涌现 。

阴离子及其通道阻断剂对大鼠主动脉张力的影响

目的 :研究阴离子及其通道阻断剂在去甲肾上腺素 (norepinephrine,NE)引起的血管收缩中的作用。 方法 :常规离体血管灌流法。结果 :阴离子通道阻断剂尼氟灭酸 (niflumicacid ,NFA)和 5 硝基 2 ( 3 苯丙氨基 ) 苯甲酸 [5 nitro 2 ( 3 phenylpropylamino) benzoicacid ,NPPB]可以抑制去甲肾上腺素NE引起的血管收缩 ;用胆碱替代灌流液中的Na+后血管张力无明显变化 ,而谷氨酸钠替代灌流液中的NaCl后血管张力下降 ,用同族元素Br-替代Cl-后血管张力增加 ,并能被NFA和NPPB所抑制。结论 :阴离子在维持血管张力中的作用比Na+更为重要 ,提示阴离子通道可能在高血压发病中起一定作用。

抗人CD8单抗κ轻链可变区基因的克隆和序列测定

OK T8杂交瘤细胞株从American typecuhure collection(ATCC)获得,产生抗人CD8分子的单克隆抗体IgG2a(γ2a,κ),为了对这一鼠源性单抗进行基因工程改造,我们首先克隆了该单抗的κ轻链可变区基因,并测定了其碱基序列,现将结果报道如下: 通过计算机查找并分析了已发表的几十株抗体的轻链可变区基因序列,经比较其5’端保守序列和J区序列,设计了一对DNA引物:GTGAATTCATGGACATCCAGATGACCCA-

人白细胞介素-3基因翻译起始区的改造提高其在大肠杆菌中的表达水平

为了提高人白细胞介素-3(hIL-3)在大肠杆菌中的表达,在计算机辅助下,设计合成了PCR突变引物,用于改造起始密码AUG上下游序列,并在不改变5＇端氨基酸编码的前提下,尽可能选用大肠杆菌高频使用的密码子。将经改造后的hIL-3cDNA和翻译起始区置于P_L启动子之下,转入大肠杆菌Tap106,经42℃热诱导后,获得表达产物,提高表达水平近一倍,表达量达到菌体总蛋白量的30％左右。表达产物经Western blot验证,经PVDF膜转移后进行N端顺序分析,证明前15个氨基酸正确,产物经包涵体纯化后,纯度提高至80％以上,初步复性后能明显促进hIL-3依赖细胞的生长。

人羧肽酶A的cDNA克隆和原核表达

目的:获得人羧肽酶A基因,为进一步构建、表达抗人精浆蛋白单链抗体/羧肽酶A融合蛋白,用于前列腺癌的抗体导向酶-前体药物疗法奠定基础。方法:从人正常肺组织中提取总RNA,经反转录PCR分离人羧肽酶A基因,并克隆入pUC19质粒中,用全自动荧光测序仪测定其序列。将该目的基因插入pBV220载体,并转入大肠杆菌DH5α中,经热诱导表达重组蛋白。结果:获得了人羧肽酶A基因(由1251bp组成,可编码417个氨基酸),与国外发表的人羧肽酶AcDNA序列一致。表达的重组蛋白以SDSPAGE分析,在Mr为49000左右处出现1条新生蛋白带,表达量约占菌体总蛋白的17%。结论:成功地克隆人羧肽酶A基因,为构建表达抗人精浆蛋白/羧肽酶A的双功能抗体奠定了基础。

培养的大鼠胃壁细胞促性腺激素释放激素的定位、克隆及序列分析

目的 研究培养的大鼠胃壁细胞GnRH的定位及其基因序列。 方法 应用免疫组织化学和原位杂交的方法进行定位研究 ;从壁细胞中提取总RNA ,应用RT PCR的方法扩增GnRH基因 ,并对产物进行纯化回收 ,连接入pUC19载体中扩增 ,经PCR和酶切鉴定后进行序列分析。 结果 大鼠胃壁细胞呈GnRH免疫反应性阳性物质位于细胞质 ,细胞核为阴性 ;壁细胞内亦可检测到GnRHmRNA杂交信号 ,信号物质位于细胞质 ,细胞核为阴性 ;同样从大鼠胃壁细胞中扩增出GnRH基因的特异性条带 ,经序列分析发现 ,扩增产物的基因序列与文献报道的大鼠下丘脑的完全一致。 结论 大鼠胃粘膜壁细胞能表达GnRH基因 ,其序列和下丘脑的完全一致 ,并能自身合成GnRH ,说明GnRH可能以自分泌或以旁分泌的方式参与胃壁细胞功能的调节。

采用定位基因缺失突变技术在大肠杆菌中高效表达肿瘤坏死因子

肿瘤坏死因子α(TNF)为157个氨基酸组成的细胞因子,在克隆的全长cDNA的5'端有480bP的非编码区包括76个氨基酸信号肽编码区。本文采用寡核苷酸指导下的定位基因缺尖突变方法,删除了这一非编码区及信号肽序列,并在成熟TNF分子第一个氨基酸密码前插入一个翻译起始密码(ATG),形成一个限制酶NcoI的识别位点CCATGG。然后取出含有成熟TNF全基因的NcoI-Pst Ⅰ片段,插入到原核表达载体pBV220中,获得了肿瘤坏死因子的高效表达菌株。活性检测结果表明,肿瘤坏死因子的表达量可达3.42×10~8u/L菌液。SDS-PAGE电泳凝胶扫描结果显示,肿瘤坏死因子在大肠杆菌的表达量可占细菌可溶性总蛋白量的22.8%。抗肿瘤坏死因子单克隆抗体可以中和大肠杆菌表达的肿瘤坏死因子对L929细胞的细胞毒性。SD和ATG间插入31个核苷酸可使TNF表达量降低约10倍。