外源核酸促核辐射鼠肠腺细胞修复的基因分析

初步探讨外源核酸促电离辐射损伤的小鼠肠腺细胞修复的分子机理 .建立BALB/c小鼠电离辐射后给予外源RNA与生理盐水治疗的 6h、 12h、 2 4h、 4d和 8d的模型 ,采集空肠组织标本后采用消减杂交基础上的LD PCR技术 ,获取与受照小鼠肠腺损伤修复相关的基因克隆 ,对其进行全自动序列分析与GenBank检索 . 6h治疗组同源性较高的序列主要为 :热休克蛋白mRNA、NmimRNA、Dutt1蛋白mRNA、Na ,K ATPaseγ亚单位mRNA等 ;12h治疗组同源性较高的序列为 :碱性磷酸酶mRNA、碱性磷酸酶 2、glkA基因、单链复制着丝粒基因等 ;2 4h治疗组同源性较高的序列为 :抗CEA单链抗体重链可变区基因、抗DNA重链可变区基因、Igkappa链mRNA等 ;4d治疗组同源性较高的序列为 :双特异性磷酸酶、端粒酶相关蛋白家族mRNA、β GABA转运基因、紧张激活蛋白mRNA、FK5 0 6结合蛋白、Ca2 +/Ca2 +调蛋白依赖性基因等 ;8d治疗组同源性较高的序列为 :免疫球蛋白可变区基因、鼠免疫球蛋白DNA、易弯曲肽DNA、tsrglkA基因、修复蛋白A等 .新发现的 18个基因片段递交给GeneBank ,接受号为AF2 40 16 4 AF2 40 181.结果表明 :外源核酸促电离辐射损伤的小鼠肠腺修复的机理可能与一些基因、蛋白质的异常表达有关 ,与免疫系统的作用可能有关 .

宫颈癌组织表皮生长因子受体对TKI敏感性相关的基因突变研究

目的研究宫颈癌组织表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因中是否存在与EGFR酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor,TKI)药物敏感性相关的18、19及21外显子突变,为本地区宫颈癌的靶向治疗提供依据。方法收集70例宫颈癌患者的新鲜癌组织标本,提取DNA,以特异性引物PCR扩增EGFR基因外显子18、19及21,进行DNA测序并分析序列相似性。结果 70例宫颈癌组织提取质量良好的DNA中,均未检测到EGFR基因18、19及21外显子突变。结论宫颈癌组织EGFR基因外显子18、19及21突变罕见。

p73基因在肺癌组织中的表达

目的：探讨ｐ７３基因在肺癌组织中的表达情况。方法：采用定量ＲＴ－ＰＣＲ技术检测４０例肺癌及其癌旁肺组织中ｐ７３基因的表达程度；采用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ技术检测肺癌与癌旁组织中ｐ７３基因的突变情况。结果：①定量ＲＴ－ＰＣＲ检出ｐ７３基因在２４例肺癌中呈中高表达，在癌旁组织中未检出高表达。ｐ７３基因在肺癌与癌旁组织中的表达率之间存在显著性差异（Ｐ＜０．０１）；在１９例中高分化标本中检出９例呈中高表达，在２１例低分化标本中检出１５例呈中高表达，两者之间存在显著性差异（Ｐ＜ ０．０１）；ｐ７３基因表达程度在１５例肺癌Ⅰ～Ⅱ期标本检出 ９例呈中高表达，２５例Ⅲ～Ⅳ期标本中检出１５例呈中高表达，两者之间无显著差异（Ｐ＞ ０．０５）。②等位基因表达分析示ｐ７３基因在１２例杂合标本肺癌组织中１０例存在Ｇ／Ｃ：Ａ／Ｔ双等位基因表达，在癌旁组织中皆为Ｇ／Ｃ表达，未见Ａ／Ｔ表达。③ＰＣＲ－ＳＳＣＰ未检出ｐ７３基因突变。结论：ｐ７３基因ｍＲＮＡ的表达可能与肺癌分化程度有关，与临床分期无关。

大肠癌相关基因表达的早期诊断意义

为了提高大肠癌的早期诊断率,我们对结肠癌、结肠息肉、溃疡性结肠炎及结肠炎患者结肠镜检查并进行病理诊断,然后对 p53,DCC,APC,C-myc,K-ras 及 p73基因进行检测,并设正常对照组,探讨多个基因与大肠癌的关系和早期诊断意义.1 材料和方法1.1 材料 1999-03/1999-10我院进行肠镜检查取结肠癌组织40例,结肠息肉组织49例,溃疡性结肠炎组织12例,结肠炎6例及正常对照组13例.年龄5岁～81岁,平均49岁.男87例,女33例.酚、氯仿、无水乙醇、蛋白酶 K、异丙醇等化学试剂购自原平试剂公司;mRNA 提取采用 Promeg 公司

mRNA差异展示研究胃癌差异表达基因

以胃癌细胞株GC790 1与胃粘膜细胞株GES 1为对比材料 ,利用mRNA差异展示技术 ,研究胃粘膜至胃癌过程的差异表达基因 ,为建立胃癌预警系统打下基础 .获得 8个未知的与胃癌相关的cDNA ,命名为GCYS 1,2 ,3,4,5 ,6 ,7,2 0 ,完成其克隆及序列分析 ,RNA印迹证实GCYS 1至 7片段与GCYS 2 0基因在GC790 1细胞株中呈高表达 ,在GES 1细胞株中呈低表达 .此 8个序列在GenBank数据库中登录 ,接受号为AF0 5 416 2～AF0 5 6 16 8及AF2 19140 .

Ndrg2基因及NDRG2蛋白的生物信息学分析

目的 :对ndrg2 (n mycdownsreamregulatorgene 2 )基因调控区和NDRG2蛋白序列进行生物信息学分析 ,从结构上预测其功能 .方法 :运用internet网络上的数据库及程序 ,对ndrg2基因的调控区和NDRG2蛋白的二级结构进行生物信息学分析 .结果 :ndrg2基因调控区存在多种转录因子结合位点 ,功能主要涉及组织特异性表达调控 ,细胞生长发育相关基因和应激反应基因的表达调控等 ;NDRG2蛋白的结构属于α/β水解酶类折叠 ,其分类预测表明与细菌环氧化物水解酶的二级结构极为相似 .结论 :生物信息学分析提示NDRG2蛋白具有一定的酶活性 ,可能参与细胞抗氧化应激反应 ,内外源有毒物质的代谢 。

全自动(定量PCR)基因扩增诊断仪配套定量试剂的研制

目的 研制一种能用于仪器操作的灵敏、快速、特异的定量试剂 .方法 使用一个生物素标记的上游引物 ,对HBVDNA及其竞争模板DNA进行不对称PCR扩增 ,使扩增出的单链带有生物素 ,并可结合在固定有链亲合素的微孔板的表面 .用标有辣根过氧化物酶的待测模板探针和竞争模板探针分别与两个微孔中固定的相应单链PCR产物杂交 ,而后加底物显色 ,测定吸光度进行分级定量分析 .结果 该定量方法可以检测 10拷贝数的模板 ,而且对简便处理的标本适应性强 ;以分级定量的形式定量时 ,具有良好的重复性 .结论 该试剂适用于仪器操作 。

非小细胞肺癌患者EGFR基因突变与吉非替尼临床疗效关联

目的:评估吉非替尼(Gefitinib)疗效和晚期难治性非小细胞肺癌(NSCLC)患者表皮生长因子受体(EGFR)突变情况的关联。方法:121名晚期难治性非小细胞肺癌患者,均是经过一线化疗方案失败的中晚期非小细胞肺癌患者,每日予以口服吉非替尼250mg治疗,直到疾病进展或出现不可耐受的毒副反应为止。在开始治疗之前检测EGFR18、19、21位点,于治疗期间进行常规检查和规范的随访。分析疗效、突变以及中位生存期之间的关联。结果:在115名有效随访的患者中,13例完全缓解,25例部分缓解,38例稳定,39例病情进展。疾病控制率66.3%。1年和2年生存率分别为59.7%和26.9%。中位生存期16个月。115人中有38例病人存在EGFR突变。EGFR突变的病人表现出对吉非替尼较敏感。不吸烟的女性患者有较好的疗效和较长的生存期。而患者年龄、一线化疗周期、肿瘤分期的组间差异对于生存期的影响都无显著差异。结论:吉非替尼在女性不吸烟非小细胞肺癌患者中疗效是确定的。西部女性肺腺癌患者拥有较高的突变率和较长的生存时间。

PCR-ELISA检测血清中HBV聚合酶YMDD基因变异

目的 用 PCR- ELISA检测 HBV聚合酶 YMDD基因的变异 .方法 采用混合引物 ,并通过降低 PCR反应体系中 d NTPs、引物等成分的浓度 ,以及提高退火温度等措施 ,对YMDD基因的各种变异型进行特异扩增 ,再采用 37℃液相杂交和 EL ISA方法对 PCR扩增产物进行检测 ,从而实现 PCR-ELISA方法进行 YMDD基因变异的检测 .结果 该方法可以检测出已知的变异 YMDD基因序列 ,可以检测 2× 1 0个拷贝的模板量 ,同时可以从 1 0 0 0个正常 YMDD基因序列中检测出 1个变异的 YMDD基因序列 ,检测结果不受正常 YMDD基因序列干扰 .对 30例经过 6mo以上拉米夫定治疗的患者血清进行检测 ,检测出 4例 YMDD基因变异 ,并经过测序证实 .结论 该 PCR- ELISA法可以对血清中 HBV

caspase-6基因诱导成骨肉瘤细胞凋亡

目的:探讨caspase-6对成骨肉瘤细胞株的凋亡诱导作用。方法:应用RT-PCR方法检测成骨肉瘤细胞株SOSP-9607中caspase-6基因的表达水平。以腺病毒adv5作载体,构建含caspase-6基因的转基因载体,用脂质体包裹法转染SOSP-9607细胞株,用RT-PCR方法检测转染后SOSP-9607细胞中caspase-6基因的表达。用MTF法检测转染caspase-6对SOSP-9607细胞株生长的影响。结果:成骨肉瘤细胞株SOSP-9607中未检出caspase-6表达。RT-PCR法证实转染。caspase-6后SOSP-9607中caspase-6表达显著增强,MTT检测显示对SOSP-9607细胞的生长有抑制作用,形态学观察及DNA电泳证实转染后的细胞株存在细胞凋亡特征。结论:caspase-6对成骨肉瘤细胞的生长有抑制作用,并可诱导成骨肉瘤细胞凋亡。

肺癌患者EGFR基因启动子甲基化状态研究

目的:探讨肺癌组织中EGFR基因启动子的甲基化水平及甲基化状态与EGFR外显子突变的关系。方法:应用聚合酶链技术、基因克隆测序技术和荧光偏振技术,检测肺癌患者病理组织中EGFR基因启动子的甲基化水平。结果:76例肺癌组织中EGFR基因启动子甲基化阳性者23例,检出率为30.3%,甲基化状态与肺癌患者的性别、年龄、吸烟史、淋巴结转移、浸润程度和TNM分期均无明显相关性,与患者的病理类型密切相关,吸烟对甲基化的相对危险度(OR)为1.88,40例NSCLC患者中,29例未检测到敏感突变的患者中有10例甲基化为阳性,甲基化率为34.5%,而11例TKI敏感突变的患者中均未检测到甲基化。结论:肺癌患者EGFR基因存在启动子甲基化,EGFR外显子的突变状态与启动子甲基化有密切关系。

克隆差异表达基因的新策略

基因表达的变化有两种 ,即新出现的基因表达与表达量差异的基因表达 .表达量差异的基因克隆技术主要有mRNA差异展示 ,此技术是目前筛选差异表达基因最有效的方法之一 ,但主要存在假阳性率高的不足 ,针对此缺点 ,近几年提出了新的策略与方法 ,如差异消减展示、基于PCR和减法杂交基础上的差异表达基因克隆技术 ,这些技术具有显著优势 .

细胞毒素相关蛋白基因A与胃粘膜组织恶变的研究

目的:研究细胞毒素相关蛋白基因A(cagA)阳性幽门螺杆菌(Hp)在胃粘膜组织恶性化转变中的作用。方法:以含Hp细胞毒素相关蛋白基因A的质粒(P^(MC3))为外参照品,在微孔板上对PCR扩增cagA的产物作探针杂交及辣根过氧化物酶酶促显色分析,定量榆测不同组织中cagA阳性Hp。结果:往50份Hp尿素酶B基因阳性的临床标本中检测到28份cagA亦阳性(56％),其中5份浅表性胃炎组织,12份癌前病变组织及11份胃癌组织。浅表性胃炎组织cagA阳性的Hp感染率(31％)及每毫克组织感染的平均拷贝数(12.8)均显著低于(P<0.01或P<0.05)癌前病变组织(60％;77.1)或胃癌组织(79％;57.6),二者在后两种组织间均无显著性差别(P>O.05)。结论:cagA阳性的Hp感染可能有助于胃粘膜组织的恶性化转变,这种转变与cagA阳性Hp的感染量有关。

外周血中EGFR、K-Ras基因突变与吉非替尼、厄罗替尼临床疗效分析

EGFR属于I型生长因子家族,具有酪氨酸激酶活性,与肿瘤发生与转移的多个环节,包括浸润、血管生成、细胞增殖和凋亡抵抗等相关。EGFR其酪氨酸激酶功能区基因突变影响着EGFR-TKIs的临床疗效。K-Ras是EGFR下游一个信号通路,它的突变提示EGFR-TKI治疗肺癌无效。

人乳头瘤病毒11型主要衣壳蛋白L1基因的克隆及序列分析

目的 从临床尖锐湿疣标本克隆人乳头瘤病毒(HPV ) 11型主要衣壳蛋白 L 1基因 ,进行序列测定及序列分析比较 ,以为研究该临床病毒株的免疫原性及流行病学奠定基础 .方法 以临床尖锐湿疣标本总 DNA为模板 ,用 L 1基因保守区简并引物以 PCR方法分段扩增衣壳蛋白 L1基因大部 ,重组入 p GEM- 3zf(- )质粒载体 ,以双脱氧法双向测定插入片段序列 ,拼接出 L1基因序列 ,通过 BL AST2 .0与已报道序列进行比较 .结果 从西安地区一尖锐湿疣临床标本克隆到的一株 HPV11型 L1蛋白编码序列与一文献报道大部分相同 ,但有些位点有点突变 .结论 构建的 p GEM- 3zf(- )重组质粒为进一步通过杂交。

宫颈癌组织高危HPV18 L1基因的克隆及序列分析

目的克隆和分析人乳头瘤病毒18型晚期表达基因L1序列,为HPV感染的检测和基因工程疫苗研制提供基础。方法采用PCR技术扩增了1例HPV18阳性宫颈腺癌患者癌组织中HPV18L1基因,并对其进行了克隆及全序列分析。结果本例宫颈癌临床标本HPV18L1基因与GenBank收录的原型比较有12个碱基变异,推导其编码的氨基酸也发生了变化。结论本例中国人宫颈癌HPV18L1基因有一定的变异。

甲基化特异性PCR检测FMR1和XIST基因甲基化实验方法的建立

建立一种快速、灵敏的检测脆性X智障基因(fragile X mental retardation,FMR1)、X染色体失活基因(Xchromosome inactivation,XIST)甲基化的方法.用亚硫酸氢钠和对苯二酚对基因组DNA进行脱氨基修饰.以修饰后的DNA为模板,用两套不同的引物对:1对甲基化特异性引物和1对非甲基化特异性引物扩增FMR1基因(CGG)n重复序列区、FMR1和XIST基因的启动子区.PCR产物进一步克隆、测序.以亚硫酸氢钠和对苯二酚脱氨基修饰后的DNA为模板进行PCR扩增后的产物与预期基因目的基因片段大小相符合,无非特异性扩增产物.测序结果表明,FMR1、XIST基因中的非甲基化的C碱基转变为U碱基,而CpG岛被甲基化的C碱基不改变.成功地建立了检测FMR1、XIST甲基化的方法,为实验室诊断脆性X综合征提供了新的方法.

结肠癌中p73基因改变的意义

目的 研究 p73基因在结肠癌中的改变及其意义 .方法 采用 PCR- SSCP方法检测 40例结肠癌及其癌旁非癌组织中 p73基因突变 ,采用定量 RT- PCR方法检测 p73基因的表达 .结果 1PCR- SSCP检测出 7例存在 p73等位基因缺失 ,未见突变 ;2定量 RT- PCR检测出 33例结肠癌呈高表达 ,7例呈中等表达 ;非癌组织中 2 6例呈低水平表达 ,14例呈中等水平表达 ;p73基因在结肠癌与癌旁组织中的表达存在显著性差异 (P<0 .0 1) .结论 p73基因以等位基因缺失。

尖锐湿疣患者人乳头瘤病毒11型L1基因的克隆及序列分析

目的克隆和分析HPV11的晚期表达基因序列L1及其编码的氨基酸序列,为HPV感染的检测和基因工程疫苗研制提供基础。方法采用PCR技术扩增了1例尖锐湿疣患者疣组织中HPV 11 L1基因,并对其进行了克隆及全序列分析。结果本例尖锐湿疣临床标本HPV 11 L1基因与GenBank收录的原型(收录号:M14119)比较有8个碱基变异。结论 中国地区尖锐湿疣HPV 11 L1基因存在着变异。

采用改进的差示PCR技术分离胃癌差异表达基因及其临床意义(英文)

目的：建立优化的差示PCR条件；运用建立的条件分离胃癌GC7901与胃粘膜GES－1细胞株之间的差异表达基因；根据获取的序列，设计引物并运用于检测胃癌组织、血、活检胃粘膜标本，拟筛选出检出率与符合率高的数对引物，建立胃癌基因诊断方法．方法：LJGC7901与GES－1细胞株为研究对象，探索mRNA差示PCR的最佳反应条件，运用优化的条件分离细胞株之间的差异表达基因；以回收的片段作探针，打点杂交证实为真正的差异片段后，对产物进行直接测序及同源性检索；设计引物，采用RT－PCR方法检测胃癌组织、血、活检胃粘膜标本．结果：优化的差示PCR条件为：前5轮PCR循环采用94℃35s，40℃2min，72℃30s，后35轮PCR循环采用94℃45s，55℃2min，72℃1min，最后在72℃延伸7min；分离回收差异条带154条，从中选出17个片段作探针，打点杂交证实在两细胞株之间呈差异表达；对17个片段进行了测序，其中17个新序列被GenBank接受，接受号为AF054162至AF054172，AF071052至AF071058；其中5个序列引物在26例胃癌标本中检出覆盖率为100％，在9例病理确诊的胃癌患者活检胃粘膜中检出率100％，在17例病理确诊为胃癌患者血标本中检出率为53％．结论：优化了mRNA差示PCR技术条件；分离出154个差异表达的基因片段；筛选出17个新序?