采用改进的差示PCR技术分离胃癌差异表达基因的研究

目的建立优化的ｍＲＮＡ差示ＰＣＲ条件；运用建立的条件及ＧＱＳ９６００分离胃癌ＧＣ７９０１与胃粘膜ＧＥＳ１细胞株之间的差异表达基因片段；根据获取的序列，设计引物并运用于胃癌组织、血、活检胃粘膜标本检测，拟从中筛选出检出率与符合率高的数对引物，建立胃癌基因诊断方法．方法以胃癌ＧＣ７９０１与胃粘膜ＧＥＳ１细胞株为研究对象，探索ｍＲＮＡ差示ＰＣＲ的最佳反应条件，运用优化的条件分离细胞株之间的差异表达基因片段；以回收的片段作探针，打点杂交证实为真正的差异片段后，对纯化产物进行直接序列分析及ＧｅｎＢａｎｋ同源性检索，同源性低的序列递交给ＧｅｎＢａｎｋ；设计引物，采用ＲＴＰＣＲ方法对胃癌组织、血、活检胃粘膜进行检测，筛选出检出率与符合率高的５对引物建立多重ＰＣＲ诊断胃癌方法．结果①优化的差示ＰＣＲ条件为：前５轮ＰＣＲ循环采用９４℃３５ｓ，４０℃２ｍｉｎ，７２℃３０ｓ，后３５轮ＰＣＲ循环采用９４℃４５ｓ，５５℃２ｍｉｎ，７２℃１ｍｉｎ，最后在７２℃延伸７ｍｉｎ；②确认并分离出差异条带１５４条，胃癌细胞株泳道中存在而胃粘膜细胞株泳道中缺失的有８２条，胃粘膜细胞株泳道中存在而胃癌细胞株泳道中缺失的有３５条，胃癌细胞株泳?

应用焦磷酸微测序技术行HLA-DRB基因型分析

目的应用焦磷酸微测序技术进行HLA-DRB基因型分析。方法PCR扩增外显子2基因片段,经链亲和素包被磁珠纯化、制备单链DNA测序模板,应用焦磷酸微测序技术进行实时测序和HLA-DRB基因分型。结果焦磷酸微测序技术一次可判读40～80个碱基,采用3-4个微测序可以判读全部扩增区域的多态性位点,测序结果与HLA数据库基因序列比较,可准确进行HLA-DRB基因型分析。结论焦磷酸微测序技术应用于HLA-DRB基因型分析具有高分辨率、高通量和快速等优点,该方法可应用于器官及骨髓移植的供体/受体筛查。

应用TDI-FP技术分析宫颈癌组织HPV16 E7基因A647G点突变(英文)

模板指导的末端碱基掺入反应结合荧光偏振检测技术(templatedirectdye-terminatorincorporationwithfluorescence-polarization,TDI-FP)是SNP检测新技术.应用TDI-FP方法分析中国陕西HPV16阳性宫颈组织HPV16E7基因第647位核苷酸A→G热点突变(即A647G),首先在HPV16阳性的91例宫颈癌及49例正常/宫颈炎妇女宫颈DNA标本中,PCR扩增含647位点在内的HPV16E7部分基因,然后将紧邻647位点5′端的寡核苷酸探针与PCR产物内的模板杂交,并延伸一个与647位点碱基互补的荧光标记碱基:TAMRA-ddTTP或R110-ddCTP.用荧光偏振仪读取荧光偏振(FP)值,根据升高的相应FP值判断647位点碱基.结果表明,宫颈组织HPV16E7A647G的总体检出率为35.71%(50/140).宫颈癌组的A→G突变率为42.86%(39/91),显著高于正常/宫颈炎组22.45%(11/49)的突变率(x2=5.778,P=0.016),两组间的OR值为2.59(95%CI=1.17￣5.71).提示TDI-FP可用于HPV有意义点突变的分析;我国陕西地区妇女HPV16A647G突变率及其对宫颈癌的警示性与其他地区相比有明显差异,该地区携带此突变病毒株的妇女患宫颈癌的风险可能较高.

痰细胞p53和ras基因突变检测诊断价值的研究

肺癌是严重危害人类健康的常见恶性肿瘤，其发病率逐年增加，临床上所诊断的肺癌的８０％属晚期，失去了手术治疗的机会，５年生存率很低。寻找能诊断尤其是早期诊断肺癌的方法十分必要。分子生物学技术的发展为肺癌的基因诊断提供了可能。作者应用聚合酶链反应－单链构象...

荧光偏振技术在单核苷酸多态性及基因型检测中的应用

单核苷酸多态性及基因型检测在多种疾病的诊断、病原体检测、组织配型、疾病预警及指导药物应用中具重要的临床价值。荧光偏振检测技术因不需特制探针、简单、敏感、成本与芯片等DNA高通量检测技术相比较为低廉 ,有在临床推广应用的价值。

DNA微阵列技术检测Duchenne型/Becker型肌营养不良患者的临床应用研究

目的 研究检测Duchenne型肌营养不良 (DMD) /Becker型肌营养不良 (BMD)患者基因缺失的可行技术。方法 应用分子克隆的方法扩增DMD基因 18个常见易缺失外显子片段 ,以此作为探针制备出简易DNA微阵列 ,对 30例DMD/BMD患者和 5例健康对照的基因进行检测分析。部分结果与PCR的方法作了比较。结果 应用简易DNA微阵列检测出 2 1例DMD/BMD患者具有不同程度的外显子缺失 ,10例经PCR检测得到了完全验证。结论 DNA微阵列技术检测DMD/BMD患者简便、准确、灵敏 ,可在临床诊断中应用。

A组轮状病毒一步法RT-PCR检测技术的建立和应用研究

目的设计A组轮状病毒RV特异性引物,应用Tth酶,建立一步法RT-PCR扩增方案,检测西安地区腹泻幼儿196份粪便标本,并与本室研制建立的反向间接血凝法RPHA,聚丙烯酰胺凝胶电泳,市售ELISA试剂盒平行检测对比分析。方法设计并合成第九基因序列保守区互补的特异性引物,在经典法RT-PCR试验成功的基础上,建立合理的一步法RT-PCR。结果四种检测结果阳性率分别为33.16%,23.47%,21.94%和25%,X2检验表明,RT-PCR最为敏感。结论反转录和PCR由Tth酶一步完成,克服了经典法中AMV、RNasin等试剂昂贵,操作繁锁等缺点,很适合临检需要。

生物芯片技术研究幽门螺杆菌的应用

分子生物学技术已越来越多的应用于幽门螺杆菌Hp的检测，检测的主要靶分子为抗Hp抗体、Hp抗原和Hp基因组。以ELISA，金标记和PCR技术为主体的分子生物学诊断技术在Hp诊断中所发挥的作用越来越大。随着分子生物技术的飞速发展，各种高新生物技术不断诞生，给Hp的分子诊断带来了新的起点和高度，现结合作者的一些研究工作，主要就生物芯片技术在Hp诊断中的应用前景做一简述。

大肠癌相关基因表达的早期诊断意义

为了提高大肠癌的早期诊断率,我们对结肠癌、结肠息肉、溃疡性结肠炎及结肠炎患者结肠镜检查并进行病理诊断,然后对 p53,DCC,APC,C-myc,K-ras 及 p73基因进行检测,并设正常对照组,探讨多个基因与大肠癌的关系和早期诊断意义.1 材料和方法1.1 材料 1999-03/1999-10我院进行肠镜检查取结肠癌组织40例,结肠息肉组织49例,溃疡性结肠炎组织12例,结肠炎6例及正常对照组13例.年龄5岁～81岁,平均49岁.男87例,女33例.酚、氯仿、无水乙醇、蛋白酶 K、异丙醇等化学试剂购自原平试剂公司;mRNA 提取采用 Promeg 公司

mRNA差异展示研究胃癌差异表达基因

以胃癌细胞株GC790 1与胃粘膜细胞株GES 1为对比材料 ,利用mRNA差异展示技术 ,研究胃粘膜至胃癌过程的差异表达基因 ,为建立胃癌预警系统打下基础 .获得 8个未知的与胃癌相关的cDNA ,命名为GCYS 1,2 ,3,4,5 ,6 ,7,2 0 ,完成其克隆及序列分析 ,RNA印迹证实GCYS 1至 7片段与GCYS 2 0基因在GC790 1细胞株中呈高表达 ,在GES 1细胞株中呈低表达 .此 8个序列在GenBank数据库中登录 ,接受号为AF0 5 416 2～AF0 5 6 16 8及AF2 19140 .

全自动(定量PCR)基因扩增诊断仪配套定量试剂的研制

目的 研制一种能用于仪器操作的灵敏、快速、特异的定量试剂 .方法 使用一个生物素标记的上游引物 ,对HBVDNA及其竞争模板DNA进行不对称PCR扩增 ,使扩增出的单链带有生物素 ,并可结合在固定有链亲合素的微孔板的表面 .用标有辣根过氧化物酶的待测模板探针和竞争模板探针分别与两个微孔中固定的相应单链PCR产物杂交 ,而后加底物显色 ,测定吸光度进行分级定量分析 .结果 该定量方法可以检测 10拷贝数的模板 ,而且对简便处理的标本适应性强 ;以分级定量的形式定量时 ,具有良好的重复性 .结论 该试剂适用于仪器操作 。

细胞毒素相关蛋白基因A与胃粘膜组织恶变的研究

目的:研究细胞毒素相关蛋白基因A(cagA)阳性幽门螺杆菌(Hp)在胃粘膜组织恶性化转变中的作用。方法:以含Hp细胞毒素相关蛋白基因A的质粒(P^(MC3))为外参照品,在微孔板上对PCR扩增cagA的产物作探针杂交及辣根过氧化物酶酶促显色分析,定量榆测不同组织中cagA阳性Hp。结果:往50份Hp尿素酶B基因阳性的临床标本中检测到28份cagA亦阳性(56％),其中5份浅表性胃炎组织,12份癌前病变组织及11份胃癌组织。浅表性胃炎组织cagA阳性的Hp感染率(31％)及每毫克组织感染的平均拷贝数(12.8)均显著低于(P<0.01或P<0.05)癌前病变组织(60％;77.1)或胃癌组织(79％;57.6),二者在后两种组织间均无显著性差别(P>O.05)。结论:cagA阳性的Hp感染可能有助于胃粘膜组织的恶性化转变,这种转变与cagA阳性Hp的感染量有关。

乙脑病毒核酸诊断方法的建立及应用

目的 建立一种新的乙脑病毒基因诊断方法 ,并进行大样本检测。方法 使用一步反转录巢式PCR进行乙脑患者血液及脑脊液的病毒核酸检测 ,并与 2 -巯基乙醇耐性试验进行对比检测。结果 2 16例乙脑就诊患者血清的PCR阳性率为 77.8% ,2 -ME阳性率为 4 5 .3 7% ,脑脊液的PCR阳性率为 93 .2 0 % ,2 -ME阳性率为 3 7.3 8% ,有显著性差异。对不同病程日乙脑患者的检测 ,在初期和极期早期PCR的阳性检测率高 ,在极期后期和恢复期 2 -ME的阳性检测率高。结论 PCR法为一种适合于乙脑早期特异性诊断的新型基因诊断技术。

采用改进的差示PCR技术分离胃癌差异表达基因及其临床意义(英文)

目的：建立优化的差示PCR条件；运用建立的条件分离胃癌GC7901与胃粘膜GES－1细胞株之间的差异表达基因；根据获取的序列，设计引物并运用于检测胃癌组织、血、活检胃粘膜标本，拟筛选出检出率与符合率高的数对引物，建立胃癌基因诊断方法．方法：LJGC7901与GES－1细胞株为研究对象，探索mRNA差示PCR的最佳反应条件，运用优化的条件分离细胞株之间的差异表达基因；以回收的片段作探针，打点杂交证实为真正的差异片段后，对产物进行直接测序及同源性检索；设计引物，采用RT－PCR方法检测胃癌组织、血、活检胃粘膜标本．结果：优化的差示PCR条件为：前5轮PCR循环采用94℃35s，40℃2min，72℃30s，后35轮PCR循环采用94℃45s，55℃2min，72℃1min，最后在72℃延伸7min；分离回收差异条带154条，从中选出17个片段作探针，打点杂交证实在两细胞株之间呈差异表达；对17个片段进行了测序，其中17个新序列被GenBank接受，接受号为AF054162至AF054172，AF071052至AF071058；其中5个序列引物在26例胃癌标本中检出覆盖率为100％，在9例病理确诊的胃癌患者活检胃粘膜中检出率100％，在17例病理确诊为胃癌患者血标本中检出率为53％．结论：优化了mRNA差示PCR技术条件；分离出154个差异表达的基因片段；筛选出17个新序?

小肠RNA对小鼠电离辐射肠道损伤修复的差异基因表达的研究

为从基因水平探讨小肠核糖核酸，促进小鼠电离辐射肠道损伤修复的机理，采用随机分组法把 ９０只小鼠分成 ４组，建立辐射后给予 ４０μｇ ＲＮＡ治疗的实验组与 ０．４ｍＬ生理盐水治疗的对照组模型，分别于照射后６、１２、２４ｈ，４ｄ和８ｄ采集小肠空肠段标本，运用消减杂交基础上的ＬＤ－ＰＣＲ技术，分离实验组与对照组之间的差异表达基因。结果表明；实验组与对照组６、 １２、 ２４ｈ， ４ｄ和 ８ｄ的消减后 ＬＤ－ＰＣＲ产物克隆成功，共获取 １６５个新克隆，其中实验组６、 １２、 ２４ｈ， ４ｄ和 ８ｄ的克隆新表达基因数分别为 １８、 ２２、 ２５、 １３和 １２个，编号依次为 ＸＣＺ１－９０，即为 ９０个与注入ＲＮＡ修复密切相关的高表达基因；对照组 ６、 １２、 ２４ｈ；４ｄ和 ８ｄ 的克隆新表达基因数分别为 ２２、 ２５、 １４、 ６和 ８个，编号为 ＡＸＣＺ１－７５，即为 ７５个可能与电离辐射损伤相关的高表达基因。本工作成功地建立了辐射后给予ＲＮＡ治疗的实验组与生理盐水治疗的对照组模型；从实验组与对照组之间分离并克隆了１６５个新基因，其中９０个与注入 ＲＮＡ修复密切相关的高表达基因。 ７５个可能与电离辐射损伤相关的高表达基因。

宫颈癌与HLA等位基因DQB1＊03、DR15的相关性研究

目的 :探讨我国陕西地区宫颈癌的发生与人类白细胞抗原 (HLA) DQB1 0 3、DR15等位基因的相关性 .方法 :采用序列特异性引物的聚合酶链式反应 (PCR SSP)方法 ,扩增HLA等位基因DQB1 0 3、DR15的目的DNA片段 (分别为 79、197bp) ,分析两对等位基因在陕西地区宫颈癌患者和正常人中分布频率的差异 .结果 :4 5名宫颈癌患者组中DQB1 0 3等位基因频率显著高于 5 0名健康对照组 ,DR15等位基因频率在两组中的分布无显著差异 .结论 :HLA等位基因DQB1 0 3可能与宫颈癌的发生具有相关性 ,DR15可能与宫颈癌的发生不存在关联 .

应用荧光偏振技术检测HBV DNA

目的 建立一种简便、灵敏、特异的DNA检测方法。方法 用荧光偏振技术检测 10 2例乙型肝炎患者血清中的HBVDNA ,并与多聚酶链反应 酶联免疫吸附试验 (PCR ELISA)方法作比较。结果 该方法可以检测出 1× 10 1拷贝的HBVDNA模板 ,CV为 6 .4 4 % ,对 10 2例乙型肝炎患者的血清进行检测 ,HBsAg( + )、HBeAg( + )、抗HBc( + )血清HBVDNA阳性率为 10 0 % ( 4 0 / 4 0 ) ;HBsAg( + )、抗HBe( + )、抗HBc( + )血清HBVDNA阳性率为 81.8% ( 2 7/ 33) ;HBsAg( + )、抗HBc( + )血清HBVDNA阳性率为 72 .4 % ( 2 1/ 2 9) ,其余为阴性。 30例非乙型肝炎患者血清中HBVDNA的检测结果均为阴性。结论 该方法简单、灵敏、特异 。

差异表达基因克隆技术的进展

分离并克隆差异表达基因，不仅有助于揭示生命的奥秘，而且还能为基因诊断与治疗提供重要的理论依据。基因差异表达的变化有两种，即新出现的基因表达与表达量差异的基因表达。以前，过多强调克隆新出现的表达基因，忽略表达量差异的基因。目前研究认为，表达量差异的基因...

胃癌差异表达基因的克隆测序及临床应用

目的 筛选数个在胃癌及癌前病变中检出率高的胃癌差异表达片段 .方法 以筛选出的 gcys- 10 ,gcys- 12 ,gcys-13,gcys- 16这 4个新基因片段为研究对象 ,将它们克隆入 T载体中进行测序 ,根据序列设计引物 ,采用 RT- PCR方法检测胃癌细胞株 GC790 1、胃粘膜细胞株 GES- 1以及胃癌、胃粘膜活检标本 .结果 4个差异基因表达片段测序后经过同源性检索均为新基因 ,被基因库收录 .收录号为 AF0 5 4171,AF0 710 5 2 ,AF0 710 5 3,AF0 710 5 6 .根据这些基因设计的 4对引物均能从 GC790 1总 RNA中扩增出相应产物 ,而 gcys- 10的引物未能从 GES- 1细胞株中扩增出相应产物 . gcys- 10在5 0例活检标本中的检出率分别为 :萎缩性胃炎 83.3% ,肠腺化生 81.8% ,疣状胃炎 5 8.3% ,胃癌 88.9% ,胃溃疡 5 0 .0 % ,十二指肠溃疡 0 ,急性胃炎 0 .在 17例胃癌手术标本的检出率为 94.1% .结论 gcys- 10 ,gcys- 12 ,gcys- 13,gcys- 16均为胃癌差异表达基因 ,其中 gcys- 10在胃癌及胃癌前病变中检出率非常高 。

高危HPV16 E4基因的表达纯化及临床应用

目的:构建人乳头瘤病毒(HPV)16 E4重组表达体并表达纯化获得HPV16 E4重组蛋白,用于检测不同人群血清相应抗体,初步探讨本地区HPV16 E4血清抗体反应与宫颈癌的相关性。方法:将HPV16E4基因与pRSET-A融合表达载体连接,获得E4表达重组体,转化大肠杆菌BL21(DE3)并用IPTG诱导表达。表达的包涵体变性后经Ni柱纯化,复性并经活性鉴定后,用以包被酶联免疫吸附实验(ELISA)板,检测正常女性、慢性宫颈炎和宫颈癌患者血清抗体。结果:pRSET-16E4表达重组体的工程菌经IPTG诱导后可表达Mr15×103的HPV16 E4组氨酸融合蛋白,表达量占菌体蛋白的30%。表达形式为包涵体,重组蛋白经Ni-NTA琼脂糖树脂纯化后,纯度达95%以上,其活性经ELISA法证实。80例正常女性、46例慢性宫颈炎和32例宫颈癌患者中,其血清抗体阳性率分别为10.00%,39.13%和28.13%,宫颈癌患者HPV16 E4血清抗体阳性率显著高于正常人,且慢性宫颈炎患者HPV16 E4血清抗体阳性率也显著高于正常人,但宫颈癌组HPV16 E4血清抗体阳性率与慢性宫颈炎组间的差异无统计学意义。结论:在pRSET-A/BL21中表达获得的HPV16 E4融合蛋白,可用于宫颈癌相关HPV的血清学研究;宫颈癌和慢性宫颈炎患者HPV16E4血清抗体阳性率均明显高于正常人。