蛋白芯片标记系统的优化研究

目的:探讨一种能够更好的制备单一均匀的纳米 免疫金颗粒的方法,使蛋白芯片在临床诊断疾病时更为灵敏、 准确.方法:利用不同的方法制备3种胶体金,用分光光度计 对其均一性和颗粒大小进行评价;用麦氏方法寻找出3种胶 体金的最佳蛋白标记量;根据免疫金的制备条件设计5种离 心条件,制备出15种免疫金;利用质控蛋白芯片、梅毒检测蛋 白芯片和弓形虫检测芯片分别对15种免疫金显色,通过 XK2100阅读仪得到其相应的灰度值,分析这些数值来确定免 疫金的稳定性和灵敏度,最终确定相对优化的免疫金及其制 备工艺.结果:在制备200mL胶体金的3种配方中以400g/L 氯金酸50μL与10g/L的柠檬酸三钠溶液8mL得到的胶体 金颗粒较为均匀;而该胶体金以30100g,离心2次得到的免 疫金能够在灵敏度和稳定性之间达到一个较好的平衡点. 结论:改进后的免疫金制备方法是更优良的方案.

BRCA2基因突变荧光偏振检测方法的建立及优化

目的:建立一种适合于大量标本的基因突变筛查方法.方法:PCR扩增包含BRCA2基因突变位点的片段,经模板指导的荧光素标记碱基掺入反应(Template Directed Dye-terminator Incorporation,TDI),荧光素标记终止碱基(R110-acyGTp或TAMRA-acyTTP)特异性掺入到检测探针的3′末端,通过检测荧光偏振值(Flourscence Polarization,FP)确定BRCA2基因突变.结果:建立了基于TDI-FP原理的突变检测方法,并对引物、dNTPs浓度、PCR反应循环数等进行了优化,对健康人及乳腺癌患者外周血标本的检测结果与PCR产物直接测序法结果完全吻合.结论:此方法可快速、高通量检测BRCA2基因突变,适用于临床诊断和大量人群筛查.

荧光偏振检测西北地区宫颈病变组织中HPV感染分型的研究

目的:分析西北地区宫颈疾病组织标本中感染HPV病毒型别的分布与患者疾病病程和年龄的关联性。方法:分别提取425例西北地区宫颈疾病组织DNA,GP5+/GP6+非对称扩增荧光偏振检测方法检测每例宫颈疾病标本组织DNA的15种HPV型别,统计分析HPV型别检测结果。结果:425例CIN及宫颈癌组织标本中,417例检测出HPV感染,感染率为98%。其中HPV16型感染101例,HPV11型感染69例,HPV6型感染56例,HPV18型感染51例,多重HPV型别感染39例。CIN I级中,高危型HPV感染阳性率为27.3%,CIN II级中,高危型HPV感染阳性率为65.1%,CIN III级中,高危型HPV感染阳性率为65%;宫颈癌中,高危型HPV感染阳性率高达70%。CIN III级中,多重HPV感染阳性率为16.8%;宫颈癌中,多重HPV感染阳性率达16%。不同年龄组,低危型HPV检测阳性率差异较大。结论:本研究中,宫颈疾病标本中HPV感染率为98%,其中,高危型和多重感染在高CIN级别、宫颈癌及60岁以上组中的感染率呈上升趋势,提示HPV感染型别与病程和年龄有一定关联。

皮质骨I型胶原的提取及胶原-明胶支架材料的制备

[目的]探索一种较理想的皮质骨I型胶原的提取方法并制备胶原-明胶支架材料。[方法]以牛皮质骨为原料,经低温液氮粉碎、梯度脱水、脱脂、脱钙处理成为脱钙骨基质粉。通过酶溶解法处理脱钙骨基质粉,经溶解、离心、透析、冻干等步骤获得皮质骨胶原,SDS-PAGE电泳、氨基酸分析等方法鉴定其特征;再以胶原、明胶通过冷冻干燥技术制备神经支架材料,扫描电镜观察其内部结构。[结果]所得胶原经SDS-PAGE电泳、氨基酸分析等方法鉴定符合I型胶原特征;制备的支架材料外观呈圆柱状,内部为孔径均匀平行排列的微管结构,具有仿生效果。[结论]皮质骨中能够获得纯度较高的I型胶原,可用于胶原材料的制作。

过表达尿嘧啶DNA糖苷酶2(UNG2)可增强HepG2细胞的抗氧化作用

目的检测尿嘧啶DNA糖苷酶2(UNG2)的糖苷酶活性,研究UNG2在肝癌细胞HepG2抗氧化损伤过程中的作用。方法构建UNG2的过表达载体,利用Western blot法检测UNG2过表达效果。在HepG2细胞过表达UNG2,免疫荧光细胞化学染色观察UNG2在细胞中的表达和定位,利用含脱氧尿苷的寡核苷酸为底物测定UNG2的DNA糖苷酶活性,利用H_2O_2毒性实验研究UNG2在HepG2肝癌细胞抗氧化存活中的作用。结果在HEK293FT细胞中成功表达了UNG2,并发现UNG2主要定位在HepG2细胞核中。酶活性实验表明UNG2可以有效地切割寡核苷酸中的脱氧尿苷位点。H_2O_2毒性实验表明过表达UNG2可以显著提高HepG2肝癌细胞在H_2O_2处理后的存活率。结论 UNG2具有特异的尿嘧啶糖苷酶活性,并且UNG2能够保护HepG2肝癌细胞抵抗氧化应激损伤。

肺癌中EGFR外显子突变丰度的荧光偏振检测

目的:建立一种基于荧光偏振技术快速、特异的检测体系,并将该体系用于检测肺癌标本中EGFR基因19、21外显子的突变丰度,以便更加全面、准确地预测靶向药物疗效以及指导临床靶向药物选择。方法:应用Primer premier 5.0软件在EGFR基因19、21号外显子突变区域上下游处设计19、21外显子各自的通用PCR引物,并设计覆盖各自突变区域的两对荧光标记探针(突变型和野生型)。以包含野生型(19、21)和突变型(19、21)的质粒分别为4种阳性标准品,空载体为阴性标准品,分别作为模板进行PCR扩增反应,将扩增结果应用荧光偏振仪进行检测,以建立突变丰度测量体系。最后,对51例肺腺癌标本进行检测,并计算出各自的突变丰度。结果:荧光偏振检测EGFR基因19、21外显子突变结果与直接测序法结果无统计学差异,且最低检测浓度为40拷贝/μl,最低检测含量可达10%。本法可提供更全面的瘤内基因变异丰度分析,有利于指导临床用药。结论:荧光偏振检测EGFR基因19、21外显子突变结果不仅灵敏度与特异性高,还能提供全面的瘤内异质性分析指标,可为临床肺癌个体化治疗效果提供预测依据。

一种新的丝氨酸蛋白酶ESP30的表达及其多克隆抗体的制备

目的:在大肠杆菌中表达ESP30蛋白,并制备兔抗ESP30抗体。方法:从嗜水气单胞菌基因组中扩增ESP30基因序列,并克隆入非融合表达载体pDH2中,在温度诱导下,表达目的蛋白,以表达的ESP30作为免疫原免疫家兔制备抗ESP30抗血清,抗体效价及特异性分别用ELISA和Westernblot法鉴定。结果:在大肠杆菌中高效表达相对分子质量(Mr)约为66000的ESP30蛋白。ELISA法检测抗血清的效价可达到1∶128000,Westernblot分析抗血清可与原核表达的ESP30蛋白特异结合。结论:成功地制备兔抗ESP30的抗血清,为进一步研究ESP30蛋白的结构和功能奠定了基础。

荧光偏振和多重聚合酶链技术在肺炎支原体、肺炎衣原体检测中的应用

目的:应用多重聚合酶链反应和荧光偏振检测技术建立一种方便可靠、简单经济的肺炎支原体、肺炎衣原体DNA同步检测方法.方法:以与肺炎衣原体、肺炎支原体16SRNA序列互补的特异、无交叉反应的两对引物在同一反应体系中行多重聚合酶链反应扩增阴阳性对照及521例患儿咽喉分泌物,将荧光偏振检测技术与模板指导的DNA末端延伸反应(TDI-FP)结合,对样本PCR扩增产物进行进一步检测,并与测序方法结果比较.结果:应用多重聚合酶链反应和TDI-FP技术检测患者521例,肺炎衣原体感染阳性121例,肺炎支原体感染阳性113例,与测序检测方法符合率100%,其中肺炎衣原体、肺炎支原体双重感染阳性10例.结论:建立了基于荧光偏振技术检测肺炎衣原体、肺炎支原体的新方法,具有良好的特异性,方便简单,无需标记探针,可用于临床检测.

健康直系亲体靶向DC-CIK细胞的制备及在恶性肿瘤免疫治疗中的应用

目的:探讨健康直系亲体负载肿瘤干细胞抗原的靶向DC-CIK细胞的制备方法及对恶性肿瘤患者的治疗价值。方法:43例恶性肿瘤患者,用智能单采机采集健康直系亲体的外周血单个核细胞,其中贴壁细胞经体外诱导产生树突状细胞(DC),悬浮细胞经体外诱导产生CIK,DC负载不同肿瘤干细胞抗原制备靶向DC细胞,将靶向DC与CIK细胞共培养制备靶向DC-CIK,检测靶向DC-CIK细胞表面分子的表达及细胞增殖情况,并将靶向DC-CIK分6次回输给43例患者,治疗3个疗程后,结合影像学等检查综合评价临床治疗的疗效,同时观察不良反应。结果:靶向DC细胞与CIK细胞共培养后,可明显刺激CIK细胞的增殖,同时CD3^+CD8^+细胞,CD56^+及CD3^+CD56^+细胞的含量明显增加,43例恶性肿瘤患者接受健康直系亲体靶向DC-CIK细胞输注,PR17例,SD 25例,PD 1例,临床疗效明显,无不良反应。结论:健康直系亲体靶向DC-CIK细胞应用于恶性肿瘤患者效果确切、无明显不良反应。

宫颈癌中HPV感染分型与EGFR靶向治疗药物敏感突变、EGFR启动子甲基化的研究

目的检测并分析宫颈癌组织标本中感染HPV病毒型别与EGFR基因启动子甲基化状态、EGFR靶向治疗药物敏感相关基因突变状态的分布与关联性，为指导宫颈癌的个体化治疗提供新思路和分子诊断技术方法。方法分别提取180例宫颈癌组织DNA，GP5＋／GP6＋非对称扩增荧光偏振检测方法检测每例宫颈癌标本组织DNA的HPV16、18、58、52型。非对称扩增荧光偏振检测方法检测每例宫颈癌标本组织的亚硫酸氢盐转变DNA的EGFR启动子甲基化状态：测序法检测每例宫颈癌标本组织DNA的EGFR基因18、19、21外显子突变状态；统计分析检On,0结果。结果本研究成功检测了宫颈癌标本组织DNA中HPV16、18、58、52型和EGFR基因18、19、21外显子突变状态，成功检测了宫颈癌标本组织亚硫酸氢盐转变DNA的EGFR启动子甲基化状态。EGFR启动子甲基化阳性65例，阳性率为36．1％。单纯HPV16阳性54例，其中EGFR启动子甲基化34例，占63．0％。HPV16阳性样本中EGFR启动子甲基化阳性比率最高。结论本研究中，宫颈癌标本中HPV感染率为100％，宫颈癌标本中未发现EGFR药物敏感相关基因EGFR18、19、21外显子突变，宫颈癌标本中EGFR启动子甲基化阳性率较高，其中，HPV16感染的宫颈癌标本中EGFR启动子甲基化阳性率较其他病毒型显著增高，提示HPV16感染与EGFR启动子甲基化有一定关联．

宫颈癌中EGFR启动子甲基化荧光偏振技术检测方法研究

目的:建立一种基于荧光偏振技术的宫颈癌组织标本中EGFR启动子甲基化检测的新方法。方法:设计通用引物,在封闭管中同时扩增EGFR启动子甲基化与非甲基化等位基因片段,再同时用序列特异的FAM或TAMRA荧光标记探针对扩增产物进行杂交检测,利用荧光偏振仪检测扩增杂交反应的荧光偏振值,确定EGFR启动子甲基化状态。应用荧光偏振法检测63例宫颈癌组织样本,并与直接测序法进行对比验证。结果:本方法检测EGFR启动子甲基化结果与直接测序法结果无统计学差异,且最低检测浓度为50拷贝/μl,最低检测含量可达10%,敏感度高。结论:本方法检测EGFR启动子甲基化灵敏度与准确度较高,为临床宫颈癌个体化治疗相关检测提供了新技术。