重组人成熟型转化生长因子β_1及其抗原表位在大肠杆菌中的表达、纯化及其免疫原性鉴定

目的研制人转化生长因子(TGF)-β1自体蛋白疫苗,并诱导小鼠产生抗人TGF-β1的中和抗体。方法将hTGF-β1及其抗原表位基因β32和β80分别克隆入pGEX-4T-1原核表达载体,并引入T细胞辅助表位(TT),转化大肠杆菌,经IPTG诱导表达。应用GST亲和层析纯化重组融合蛋白,并经Westernb lot鉴定,用流式细胞术(FCM)检测抗hTGF-β1抗血清与人肝癌细胞株SMMC-7721表面膜型TGF-β1的结合状况。用纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,通过ELISA检测血清中抗hTGF-β1抗体的效价。结果成功构建了人成熟型TGF-β1及其不同表位基因片段的重组表达质粒pGEX-TT-β32、pGEX-TT-β80和pGEX-TT-hTGF-β1,表达的3种重组蛋白(GST-TT-β32、GST-TT-β80和GST-TT-hTGF-β1)经Western blot鉴定显示,同时具有hT-GF-β1和GST的抗原性。经纯化后免疫BALB/c小鼠,血清抗人TGF-β1抗体的效价均达到1∶104,其中GST-TT-β80的抗体效价最高。FCM显示3种重组蛋白免疫的小鼠抗血清均能与高表达膜型TGF-β1的人SMMC-7721结合,但重组蛋白GST-TT-β80和GST-TT-hTGF-β1免疫组抗血清的结合率明显高于GST-TT-β32组。结论构建的人成熟型TGF-β1及其不同表位片段的不同融合蛋白疫苗均能够诱导BALB/c小鼠产生抗人TGF-β1的中和抗体。

重组人B7-H4IgV融合蛋白的表达、纯化及活性

目的表达、纯化重组人B7-H4IgV融合蛋白,并检测其活性。方法将人B7-H4胞外片段IgV区基因插入pQE-30原核表达载体,转化大肠杆菌,IPTG诱导表达。表达产物经Ni2+-NTA柱亲和层析纯化,并进行Westernblot鉴定。用纯化的rhB7-H4IgV蛋白免疫昆明小鼠,经ELISA、流式细胞术测定小鼠抗血清的活性;免疫SP2/0荷瘤小鼠,观察对肿瘤细胞生长的抑制作用。结果表达的rhB7-H4IgV蛋白约占菌体总蛋白的25%,纯化后蛋白纯度为93%,浓度约为0.5mg/ml,与抗His单抗可产生特异性反应条带。免疫昆明小鼠产生的抗血清效价可达1∶10000,可与SP2/0肿瘤细胞结合。rhB7-H4IgV蛋白对SP2/0移植瘤生长具有一定的抑制作用。结论已成功表达并纯化了重组人B7-H4IgV融合蛋白,纯化蛋白可诱发小鼠体内免疫应答,产生的抗体能与表达B7-H4的肿瘤细胞SP2/0结合,rhB7-H4IgV蛋白在一定程度上能抑制SP2/0移植瘤的生长。