医学研究生药物基因组学教学探讨

该文主要分析了药物基因组学在研究生医学教育中的重要性和特点,从教学内容、手段和教学考核方式,提高教学质量和水平,开展教学科研实践活动等方面,对医学研究生的药物基因组学教学进行了初步探讨。

前沿性新课程药物基因组学教学难点剖析及对策

药物基因组学是"精准医学"的基石,基于临床实际和高校自身改革的需求,有必要开设药物基因组学这门课程。作为一门前沿性知识内容较强的课程,药物基因组学教学中存在无合适统编教材、教学重点难点不够明确等突出问题。针对上述问题,我们通过自编校本教材、集体备课整理知识点、丰富提高教学手段等多种方法和途径,取得了良好的教学效果。

本科生基因工程教学改革初探

基因工程是高等教育中生物技术专业的主干课程,其突出特点是技术性强。为了使学生易于理解和掌握该门课程,并具有较强的科研交流能力,在早期教学实践的基础上进行了部分教学改革,通过调整理论课和实验课设置,增设基础综合实验及双语教学,突出案例和基于问题的教学等,提高了教学效果。

本科生基因工程教学的实践

从教学手段、教学方法、教学内容等方面,对基因工程教学中存在的问题进行探讨和改进,进一步灵活运用多媒体教学手段、加强课堂师生交流、改变课堂小结方式、调整教学内容、重视实验教学,以提高理论教学和实验教学的质量和效果。

大学课堂教学中科学精神培养的探索与研究

科学精神培养是素质教育的重要内容,大学专业课堂教学是大学教育的主要部分,因此,专业课堂教学应发挥培养科学精神的作用。教师首先应树立培养科学精神的教学理念,通过精心设计教学内容、注重介绍本学科发展历史、灵活选择应用互动式教学模式等课堂教学改革,使专业课堂成为教师与学生学习知识、交流思想、启迪智慧的互动平台。

焦磷酸测序检测RARβ2基因启动子甲基化方法的建立

目的:建立基因启动子甲基化的焦磷酸测序检测方法,为基因启动子甲基化标志物的检测奠定基础.方法:从正常人全血中提取基因组DNA.采用复合巢式PCR的方法扩增目的基因,克隆构建对照标准品质粒.使用甲基化特异性焦磷酸测序检测RARβ2基因启动子CpG岛的5个甲基化位点,双脱氧测序验证.将阳性和阴性对照标准品质粒PCR扩增产物按不同比例混合后进行焦磷酸测序,检测每个点的甲基化程度,制作校正曲线.结果:构建了甲基化特异性焦磷酸测序阴性对照和阳性对照标准品.经焦磷酸测序检测后,阴性对照标准品甲基化程度为0%,阳性对照标准品甲基化程度为100%,与双脱氧测序结果一致.经对混合样品检测,甲基化频率符合线性关系,线性相关性大于0.99,斜率约为1,并且所有位点的标准偏差约为1%.结论:成功构建了甲基化特异性焦磷酸测序检测RARβ2启动子区域甲基化阳性对照和阴性对照标准品质粒.建立了甲基化特异性焦磷酸测序检测基因启动子甲基化的方法.

胸腺素α1二聚体蛋白的克隆、表达、纯化及其生物学活性检测

目的:获得具有生物学活性的重组人胸腺素α1二聚体蛋白.方法:人工合成胸腺素α1二聚体基因,并将该基因克隆入原核表达载体pET-22b(+)中.转化宿主细胞大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达重组Tα1②蛋白.对表达产物进行SDS-PAGE电泳和Western Blot检测分析以及生物学活性检测.结果:Tα1②Mr约为6.3×103,与理论值一致.成功纯化了Tα1②蛋白,该蛋白具有与T1抗体特异性的结合能力并能刺激小鼠T淋巴细胞增殖.结论:成功地克隆、表达和纯化Tα1②蛋白;重组Tα1②具有与化学合成Tα1相同的功能并有更高的生物学活性.

NDRG2基因启动子甲基化与肺腺癌细胞中mRNA表达相关性的实验研究

目的:探讨肺腺癌细胞中NDRG2基因启动子甲基化状态及其与基因表达的关系。方法:甲基化焦磷酸测序技术检测启动子区域甲基化状态,荧光定量PCR技术检测不同药物浓度下培养细胞中NDRG2基因mRNA的表达水平,分析启动子区域甲基化与基因表达之间的关系。结果:在体外培养细胞中检测到NDRG2基因启动子区域呈现不同程度的甲基化,甲基化频率分别为肺癌A549细胞71.8%、GLC-82细胞86.1%、人脐静脉内皮ECV-304细胞36.8%、胃上皮GES-1细胞42.9%。NDRG2基因mRNA表达与其启动子甲基化程度成反比,甲基转移酶抑制剂5-杂氮-2-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)作用于细胞后,A549和GLC-82细胞中NDRG2基因的mRNA转录明显上调,至72 h差异显著(P<0.05)。结论:肺腺癌细胞中NDRG2基因启动子CpG岛存在高甲基化,甲基化程度与该基因的表达具有负相关性,5-Aza-CdR能在一定程度上提高NDRG2的转录水平。

反向荧光偏振(FP)检测血清中HBV多聚酶基因突变

目的:建立简便的HBV多聚酶基因序列中拉米呋啶耐药性相关的基因突变的检测方法。方法:利用pfu酶的3′-5′外切校正功能和荧光偏振光检测技术进行点突变的检测。首先PCR扩增HBV多聚酶基因,然后用3′标记荧光分子FAM的探针与扩增产物中待测核苷酸的下游序列杂交,使探针3′第一个碱基与靶序列中待测点的碱基配对。若碱基配对正确,pfu酶可以沿探针的3′端延伸;若碱基配对错误,pfu酶须将探针3′标有荧光分子的核苷酸切掉,然后再沿探针3′端延伸。由于第一种情况,荧光分子与DNA链相连,分子量增加,则荧光偏振光值增大;而第二种情况,荧光分子与探针分离,荧光分子的整体分子量减小,则荧光的偏振光值减小,这样可以通过荧光偏振光值的大小判断待测点核苷酸的改变。结果:该方法可以检测出HBV多聚酶基因序列中特定位置的核苷酸类型,可以检测1×101个拷贝的模板量。对30例经过6个月以上拉米呋啶治疗的患者血清进行检测,检测出其中有3例是甲硫氨酸(M)密码子ATG中的A→G变异;2例是ATG中的G→C变异;1例是ATG中的G→T。结论:该技术可以对血清中HBV多聚酶基因序列中点突变以及其他基因突变进行检测。

siRNA沉默SOCS1表达增强IFN-α2a-NGR的抗肿瘤效应

目的:研究肿瘤血管导向性干扰素IFN-α2a-NGR抗肿瘤效应的分子机制,发现影响干扰素敏感性的关键信号分子,提高耐药肿瘤细胞敏感性。方法:培养IFNAR高表达细胞株A549、IFNAR低表达细胞株MKN-45,通过MTT检测IFN-α2a-NGR的抗细胞增殖活性,流式细胞术(FCM)、Western blot检测IFN-α2a-NGR处理前后STAT1、p-STAT1、p53、OAS与SOCS1的表达变化,合成siRNA靶向干涉SOCS1。结果:IFN-α2a-NGR刺激后,A549中,p-STAT1、p53、OAS与SOCS1表达上调;MKN-45中P53、OAS无显著变化,SOCS1显著上调。靶向干涉SOCS1后,MKN-45对IFN-α2a-NGR的敏感性增加[抑制率从(14.69±1.05)%提高到(36.97±2.05)%]。结论:IFN-α2a-NGR与IFN-α2a在细胞和分子水平的效应基本一致,p-STAT1、p53与SOCS1可影响细胞对干扰素的敏感性,通过siRNA沉默技术可提高耐药细胞株敏感性,为IFN-α2a-NGR的进一步研发奠定了基础。

负载肺癌干细胞膜微粒的DC-CIK对耐药肺癌细胞的靶向杀伤作用及对肺癌干细胞凋亡的影响

目的:探讨负载肺癌干细胞膜微粒的DC-CIK细胞对EGFR-TKI耐药肺癌细胞的杀伤作用及对肺癌干细胞凋亡的影响机制。方法:无血清悬浮细胞培养法富集EGFR-TKI耐药肺癌细胞A549、H292干细胞样细胞,RT-PCR检测干细胞标志物,裸鼠成瘤实验鉴定致瘤性。超滤和差速离心法获取肺癌干细胞膜微粒。流式细胞术分别测定共孵育组和常规培养组DC成熟标志CD86和CD83,测定两组DC-CIK细胞表型CD3^+、CD3^+CD8^+、CD3^+CD56^+、CD3^+CD4^+;形态观察及MTT法分别测定不同效靶比两组DC-CIK对A549、H292的杀伤效应;ELISA法分别检测两组DC-CIK上清中IL-2、IFN-γ、TNF-α分泌水平;流式细胞术分别测定两组DC-CIK对肺癌干细胞凋亡的影响。结果:富集培养获得的EGFR-TKI耐药肺癌干细胞样细胞高表达干细胞标志物Sox2和Oct4,并具较强裸鼠致瘤性。负载膜微粒的DC成熟标志CD86和CD83较常规DC表达显著升高;负载膜微粒的DC-CIK较常规DC-CIK细胞表型CD3^+、CD3^+CD8^+、CD3^+CD56^+、CD3^+CD4^+升高,对EGFR-TKI耐药肺癌细胞杀伤效应高于常规DC-CIK,并具有显著提高的靶向趋向性;负载膜微粒的DC-CIK分泌因子对EGFR-TKI耐药肺癌干细胞样细胞凋亡的影响与常规DC-CIK不同。结论:与常规培养DC-CIK相比,负载膜微粒的DC-CIK活性提高,对EGFR-TKI耐药肺癌细胞的体外特异靶向杀伤效应显著提高。细胞分泌因子可显著上调耐药肺癌干细胞的细胞凋亡率。

几类实体肿瘤对IFN-α 2a治疗敏感性与其细胞表面受体表达的关系

目的:探讨肿瘤细胞表面干扰素α受体的表达与其肿瘤对IFN-α 2a治疗敏感性之间的关系.为建立干扰素α敏感肿瘤的快速评价方法奠定基础.方法:MTT法体外筛选IFN-α 2a敏感与抗性肿瘤细胞株,选取人肺腺癌细胞A549,SPC-A-1,GLC-82和人低分化胃腺癌细胞MKN-45共4株细胞;通过构建荷瘤裸鼠模型,证实不同肿瘤对干扰素治疗的敏感性存在差异.流式细胞术、免疫组织化学、Western Blot检测肿瘤细胞表面IFN-α受体的表达差异.结果:体内、体外实验结果表明:A549,SPC-A-1为IFN-α 2a敏感性细胞株,MKN-45,GLC-82为IFN-α 2a抗性细胞株.细胞和组织水平检测的结果表明:表达量由高到低依次为A549,SPC-A-1,MKN-45,GLC-82.结论:IFN-α受体表达的高低与肿瘤细胞对干扰素的敏感性具有密切的相关性,对实现有针对性的个体化治疗具有一定的指导意义.

荧光PCR检测乙型肝炎病毒cccDNA方法的建立

目的:建立特异、灵敏的荧光PCR检测乙型肝炎病毒cccDNA的方法。方法:首先用煮沸法提取血清中的HBVDNA,然后用绿豆核酸酶(Mung Bean Nuclease)消化松弛环状HBVDNA(rcDNA),保留共价闭合环状DNA(cccDNA)。设计一条嵌合引物,该引物分为两部分序列,近5′部分为人为设定的序列,近3′部分是与正链缺口下游互补序列。先用该嵌合引物以正链为模板,自HBV cccDNA1590nt开始向上游延伸,然后以嵌合引物中人为设定的序列为下游引物、与负链互补的上游引物以及一条在两引物之间与正链互补的Taqman探针,扩增检测嵌合引物延伸的产物。由于带有缺口的HBV rcDNA无法被嵌合引物延伸,因此最终只能扩增检测到cccDNA。结果:用含有相应HBV DNA片端的PUC19质粒模拟HBV cccDNA,该检测方法的检测灵敏度为1×103拷贝/ml;以模拟松弛环状DNA(rcDNA)与模拟HBV cccDNA按不同比例混合,在rcDNA与cccDNA的比为1×109拷贝/ml:1×103拷贝/ml时,该方法仍可检测到模拟cccDNA;单独检测模拟rcDNA浓度为1×109拷贝/ml时,该方法检测未出现假阳性。结论:该检测乙型肝炎病毒cccDNA的方法操作简单、灵敏、特异,适用于检测血清中HBV cccDNA。

HeLa细胞中可溶性MHCⅠ产生于晚期内体

可溶性主要组织相容性复合体I （ soluble major histocom-patibility complex class I , sMHC I ）,近年来逐渐成为研究热点。该类分子II司造血系统恶性肿瘤疾病相关…，在患者的m清中，其水平显著升高。柜功能E，sMHCI可通过诱导凋亡的方式清除抗肿瘤细胞，具有免疫逃逸分子功能，然而其产生机制还不清楚。

肿瘤个体化医疗——路在何方?

药能救人,也能杀人。同样的药对有的人安全有效,对有的人却无效,甚至会发生不良反应。药物反应的差别最终引起了医学史上的一场个体化医疗革命。研究表明,除了性别、年龄等因素外,遗传因素是引起药物反应差异的主要原因。基于现有化疗药物的肿瘤药物基因组学研究在各个领域正如火如荼地展开,通过仔细分析,发现这条路虽愿望良好,但过程曲折、代价昂贵、价值有限,而且是以瘤为本。那么肿瘤个体化医疗该如何实现呢?要实现肿瘤个体化医疗,药物研发不能再走以药为本和以瘤为本的路线,而是走以人为本的路线,即先应用药物基因组学从特定人群寻找药物设计靶标,再围绕靶标进行个体化药物研发,最后以特定人群为药物临床试验对象完成新药研发过程。

重组人B7-H1IgV疫苗对小鼠骨髓瘤细胞的抑制作用

目的:探讨重组人B7-H1IgV融合蛋白对小鼠骨髓瘤的预防和治疗效果及其对荷瘤小鼠外周血中CD4+CD25+T细胞水平的影响.方法:用重组人B7-H1IgV融合蛋白免疫小鼠,待抗体产生后接种SP2/0肿瘤细胞作为预防组;用重组人B7-H1IgV融合蛋白免疫小鼠,同时接种SP2/0肿瘤细胞作为治疗组.监测小鼠体质量、肿瘤体积的变化及生存期;检测小鼠体内CD4+CD25+T细胞水平.结果:重组人B7-H1IgV融合蛋白在预防组和治疗组中均显示出了较好的抑瘤作用,并可显著降低治疗组小鼠体内CD4+CD25+T细胞水平.结论:重组人B7-H1IgV融合蛋白能够引起小鼠的体液免疫,并抑制SP2/0肿瘤细胞的生长,从而延长荷瘤小鼠的生存期.rhB7-H1IgV融合蛋白肿瘤疫苗有望成为一种肿瘤免疫治疗的候选者.

GSI对机械性损伤的神经元保护作用

目的探讨γ-分泌酶抑制剂(GSI)对神经元机械性损伤的保护作用。方法原代培养小鼠皮层神经元,培养基中加入10μmol/L GSI共同孵育24 h后,使用微量移液器枪头做机械性划伤。测定培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活力的变化;Hochest染色测定神经元凋亡情况;Western blot方法检测切冬酶-3(caspase-3)蛋白表达情况。结果 GSI预处理可抑制因细胞损伤引起的LDH的释放,可降低损伤后Hochest阳性细胞的数量以及活化caspase-3的表达。结论 GSI对神经元机械性损伤有保护作用。

负载肿瘤干细胞膜微粒的DC-CIK/CTL细胞协同西妥昔单抗对结直肠癌细胞的杀伤作用及其机制

目的:探讨负载结直肠癌干细胞膜微粒(membrane microparticles,MMPs)DC-CIK与西妥昔单抗(Cetuximab,C225)对EGFR靶向药耐药结直肠癌细胞的靶向协同杀伤作用及其机制。方法:PCR法检测结直肠癌SW480、SW620、HCT116株细胞k-RAS突变状态,无血清悬浮细胞培养法富集SW480、HCT116肿瘤干细胞,RT-PCR检测干细胞标志物Sox-2和Oct-4。提取外周血单个核细胞培养DC与CIK,将结直肠癌干细胞MMPs负载DC后再与CIK共孵育。形态观察及MTT法分别检测DC-CIK/CTL细胞及其培养上清、C225单独和合并处理对SW480、SW620、HCT116及其干细胞的杀伤效应;RT-PCR检测DC-CIK/CTL细胞培养上清、C225单独和合并作用对SW480、SW620、HCT116细胞凋亡相关基因Fas和上皮细胞间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关E-钙黏蛋白和波形蛋白基因的表达,划痕实验测定DC-CIK/CTL细胞培养上清、C225单独及联合作用对结直肠癌细胞侵袭行为影响。结果:SW480、SW620和HCT116细胞均为k-RAS突变型;富集培养获得的结直肠癌干细胞样细胞高表达Sox-2和Oct-4 mRNA。MMPs负载DC-CIK/CTL细胞及其分泌上清与C225对结直肠癌细胞的抑制有协同作用。C225与MMPs负载DC-CIK/CTL上清联合组相对于两者单独作用组能提高Fas与E-钙黏蛋白基因的表达;联合组的迁移率比两者单独作用组小。结论:负载结直肠癌干细胞MMPs的DC-CIK/CTL细胞对EGFR靶向药耐药结直肠癌细胞有体外特异靶向杀伤效应,且与C225显著协同,其发生机制与逆转细胞EMT和诱导细胞凋亡有关。

蛋白质芯片定量检测乙肝表面抗原系统的建立

目的：建立以蛋白质芯片检测乙肝表面抗原的方法,以期对乙肝患者血清中HBsAg进行定量检测,帮助动态分析病情和评估疗效。方法：用点样仪将一种抗-HBsAg单抗点到硝酸纤维素膜（NC膜）上制成芯片,HRP标记另一种抗-HBsAg单抗,以双抗夹心法捕获血清中HBsAg,建立HBsAg浓度与检测点灰度间关系的标准曲线并通过芯片阅读仪进行定量分析。结果：建立的蛋白质芯片检测系统能快速准确地对血清中HBsAg进行定性和定量检测,系统的定量检测范围是1-10000 ng/ml。结论：蛋白质芯片检测系统具有微型化和自动化的优点,与PCR HBV-DNA相比其操作更简便,所需时间更短,可以代替传统的ELISA方法,是更为科学的疗效评估方法。

应用Logistic回归与多因子降维法分析胃癌易感基因多态性

目的应用Logistic回归与多因子降维法(multifactor dimensionality reduction,MDR)分析胃癌易感基因多态性,为胃癌的早期诊断和预警奠定基础。方法采用病例-对照研究,以中国西北476例汉族胃癌患者为病例组,361名非肿瘤、非消化系统疾病个体为对照组;通过候选基因策略,应用MassARRAY质谱平台分析与代谢、炎症相关的18个基因的37个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点;利用Logistic回归与MDR对基因分型结果进行分析。结果 Logistic回归分析显示,磷脂酶Cε1(phospholipase C epsilon 1,PLCE1)_rs3765524[OR=1.341,95%CI(1.003,1.792)]、还原型辅酶Ⅰ/Ⅱ醌氧化还原酶1[NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1,NQO1]_rs1800566[OR=0.615,95%CI(0.418,0.903)]、X线修复交叉互补基因1(X ray repair cross complementing gene 1,XRCC1)_rs25487[OR=0.688,95%CI(0.490,0.967)]3个SNP位点的基因型分布与胃癌易感性显著相关(P<0.05);MDR分析显示,PSCA_rs10216533-XRCC1_rs25487[模型Ⅰ:OR=3.566,95%CI(2.614,4.863)]、MTHFR_rs1801131-PSCA_rs2976392-CYP17A1_rs6163-CYP19A1_rs4646-CYP19A1_rs1902586-MMP2_rs243865[模型Ⅱ:OR=7.257,95%CI(5.337,9.870)]、IL1B_rs16944-PSCA_rs10216533-CYP17A1_rs6163-NQO1_rs1800566-ENOSF1_rs2298581-XRCC1_rs25487[模型Ⅲ:OR=15.837,95%CI(11.252,22.289)]3个模型内部各位点之间具有显著交互作用(P<0.000 1)。结论 PLCE1、NQO1、XRCC1、PSCA、MTHFR、CYP17A1、CYP19A1、MMP2、IL1B、ENOSF1等基因多态性与我国西北地区汉族人群胃癌发病风险相关;在胃癌的早期诊断与预警中应联合Logistic回归和MDR等方法,兼顾单因素与多因素交互的影响进行综合分析。