肠易激综合征发病机制的初步研究

肠易激综合征发病机制的初步研究第四军医大学西京医院全军消化病研究所（西安７１００３２），第一军医大学杨云生张振书宋于刚张万岱周殿元冯福才陈昱肠易激综合征（ｉｒｉｔａｂｌｅｂｏｗｅｌｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＩＢＳ）是一种肠运动功能紊乱性疾病，发...

腺病毒细菌重组系统表达Crg-2蛋白的实验研究

目的利用腺病毒的细菌重组系统表达同时具有免疫趋化及血管抑制活性的趋化性细胞因子Crg-2重组蛋白。方法首先在大肠杆菌BJ5183中将穿梭质粒pShuttle-cmv/crg-2与AdE1区基因缺失的骨架质粒pAdEasy-1进行同源重组,筛选后脂质体法转染入具有AdE1区组成性表达的293包装细胞中进行病毒包装、扩增;Westernblot检测病毒感染293细胞的蛋白表达;趋化实验检测感染细胞上清对激活T淋巴细胞的趋化活性。结果穿梭质粒pShuttle-cmv/crg-2与骨架质粒pAdEasy-1重组后,经酶切及PCR鉴定获得重组腺病毒基因组质粒pAd/crg-2;病毒Ad/crg-2经包装并扩增后,用组织培养感染半数剂量法(TCID50)法测定病毒滴度达4×109TCID50/L,感染细胞经Westernblot检测有一接近Mr10000蛋白条带,分泌上清对激活的脾淋巴细胞有明显的趋化作用。结论采用细菌重组法成功获得重组腺病毒Ad/crg-2,可高效表达趋化性细胞因子Crg-2。

microRNAs与肝病的研究

近年动植物中发现一类普遍存在的非编码小RNA—microRNAs(miRNAs)。作为人体内最大的一类基因表达调控因子,miRNAs参与发育、增殖、分化、凋亡等多种重要的生物学过程,并在许多疾病过程中扮演重要角色,包括病毒复制和肿瘤的发生。miRNAs作为一类新的分子靶标,应用于疾病诊断和治疗具有广阔的前景。本文就miRNAs与肝炎病毒复制和肝癌发生的最新研究进展作一综述。

细胞凋亡与消化系疾病

细胞凋亡是不同于坏死的一种细胞死亡形式,对一些消化系疾病的转归可能起有特殊作用。本文就细胞凋亡的基本特征、分子机制及消化系疾病中的凋亡现象作简要的综述。

人环氧合酶-2(hCOX-2)编码基因的克隆及其反义核酸转染胃癌细胞的初步研究

目的环氧合酶-2与肿瘤发生的关系已成为肿瘤研究的新热点之一,本研究旨在获得 hCOX-2编码基因序列,构建其正、反义真核表达载体,并用反义重组载体转染 COX-2高表达的胃癌细胞,以进一步研究其生物学作用及其在肿瘤发生中的作用机制。方法按文献报道的hCOX-2核苷酸序列设计合成 PCR 引物,利用总 RNA 抽取试剂盒从 COX-2高表达的培养的人胃癌细胞系 SHC7901中提取细胞总 RNA,反转录合成 cDNA,再用PCR 方法扩增目的基因序列,PCR 产物经 DNA 序列测定证实后,利用引物5端引入的 EcoRⅠ,Xba Ⅰ酶切位点,通过粘端连接,将所获目的基因分别按正、反两个方向定向克隆入真核表达载体 pcDNA3.1中,对两种重组质粒分别进行相应的酶切鉴定,采用脂质体介导的方法用 COX-2反义核酸转染 SGC7901细胞,经 G418筛选后,随机挑选细胞克隆,通过 RT-PCR 检测COX-2 mRNA 水平的变化。结果应用 RT-PCR 反应扩增获得大小约1.9kb 的特异性片段,经 DNA 序列分析,证实与文献报道的 hCOX-2编码区序列一致,重组正义表达载体 pcDNA3.1/hCOX2(+)用 EcoRⅠ,Xba Ⅰ双酶切后,产生大小约5.4kb,1.9kb 的片段;重组反义表达载体 pcDNA3.1/hCOX2(-)通过 PstⅠ酶切,产生大小约4.5kb,1.5kb 与1.3kb 的片段,与预期结果相符,转染细胞经筛选后,随机挑选、扩增了3个细胞克隆,其中1个克隆稳定表达 COX-2反义核酸,RT-PCR 提示其 COX-2 mRNA 水平显著下降.结论成功克隆了 hCOX-2编码基因序列,并构建了其正、反义真核表达载体.反转录 PCR 是克隆基因的简便、有效方法.为扩增高 GC 含量的 cDNA 模板,可在 PCR 反应体系中加入适量的 DMSO,并采用较高退火温度.在 PCR 引物中加入限制性内切酶位点,可以方便地实现基因的定向克隆.COX-2反义核酸在胃癌细胞系 SGC7901中得到稳定转染,转染细胞 COX-2mRNA 表达显著受抑制.

经颈静脉肝内门体静脉分流(TIPS)术后并发肝性脑病的临床分析

目的研究经颈静脉肝内门体静脉分流(TIPS)术后患者肝性脑病的发生机制及与手术方式/支架规格的关系,改进TIPS手术。方法对我科1999～2006年间225例患者的术前及术后肝功、血氨,及手术中使用支架规格,穿刺门静脉情况,曲张静脉栓塞情况等资料进行统计、分析。结果行TIPS术后临床症状和体征均得到不同程度改善,急诊出血停止,腹水逐渐消退。穿刺门脉左支患者肝性脑病发生率明显低于穿刺门脉右支。使用8mm支架肝性脑病发生率亦明显低于使用10mm支架。结论选择门静脉左支作为门腔静脉分流道,植入8mm内径血管支架,可以显著降低肝性脑病发生率,并保护肝功能,而对分流道远期开通率无明显差异。

ERCP诊治胆胰疾病的临床应用

目的 :研究ERCP在诊治胆胰疾病中的临床应用 .方法 :对 1996 0 1/ 2 0 0 1 12我所临床应用ERCP诊治的 114 7例疾病患者进行回顾性分析 .结果 :治疗性ERCP由 1997年的 6例 (12 .4 % )上升到 2 0 0 1年的 2 6 1例 (87.6 % ) ,逐渐取代了诊断性ERCP ;ERCP在胆胰疾病诊治中的应用范围逐渐扩大 ;十二指肠乳头切开术和胆道取石术是治疗性ERCP中最多的术式 ,在胆胰疾病的治疗中占主要地位 .结论

巴豆提取物诱导小鼠小肠组织中蛋白质差异表达的初步研究

目的 建立和优化蛋白质分子差异展示的双向聚丙烯酰胺凝胶电泳技术 ,初步观察巴豆提取物诱导小鼠小肠组织中蛋白质的差异表达 ,为进一步筛选其中介导巴豆生物作用的蛋白质分子奠定基础。方法 应用巴豆提取物灌胃制备小鼠慢性胃肠运动增强模型 ,提取其小肠组织中总蛋白质 ,优化蛋白质分子差异展示的双向聚丙烯酰胺凝胶电泳技术 ,并用其分析模型动物小肠组织中蛋白质 ,双向电泳凝胶银染法显示其蛋白质的差异表达。结果 建立了小鼠慢性胃肠运动增强模型 ,优化并运用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳技术展示出模型动物小肠组织中有差异蛋白质的表达。结论 巴豆提取物可以诱导小鼠小肠组织中蛋白质差异表达 。

胃癌及癌前病变中端粒酶活性的表达

观察端粒酶活性在胃癌及胃癌前病变细胞和组织中的表达．方法：采用蜡膜介导热启动端粒重复扩增PCR模型方法．结果：胃癌细胞株端粒酶活性3株均呈阳性，在38例胃癌中，32例端粒酶活性阳性，其中进展期胃癌为30／35，早期胃癌为2／3，而邻近胃组织为2／38，在29例胃癌前病变中，5例端粒酶活性阳性，其中不典型增生轻度、中度及重度分别为1／8，l／4和1／3，肠上度化生和胃息肉分别为1／8和1／6．结论：端粒酶的活化在胃癌的发生、形成及发展过程中可能起着非常重要的作用．

RUNX3基因对人乳腺癌细胞BCAP-37药物敏感性作用的实验研究

目的:探讨RUNX3基因对人乳腺癌细胞BCAP-37的药物敏感性的调节作用。方法:构建RUNX3基因的小干扰RNA载体并将其转导入BCAP-37细胞,获得稳定转染的阳性克隆后,应用RT-PCR和Western blot进行鉴定;MTT法检测细胞转染前后药物敏感性的变化;流式细胞仪检测细胞转染前后对多柔比星的蓄积浓度的变化;DNALadder法和流式细胞仪检测细胞转染前后对DDP诱导的凋亡的变化;RT-PCR和Western blot检测耐药相关蛋白P-gp和MRP,凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达变化。结果:成功构建了RUNX3的小干扰RNA载体;成功建立了稳定的RUNX3低表达的乳腺癌细胞模型;下调RUNX3的表达能够显著降低BCAP-37细胞对长春新碱(P=0.011)、多柔比星(P=0.0004)5-FU(P=0.005)和DDP(P=0.0002)的敏感性,减少细胞内多柔比星的蓄积;转染RUNX3小干扰RNA后的细胞的抗凋亡能力明显增强,且高表达P-gp和Bcl-2,而Bax和MRP基因表达未见明显变化。结论:下调Runx3基因能够降低乳腺癌细胞对化疗药物的敏感性,提示RUNX3在乳腺癌的发生和发展中可能扮演重要角色。

Wilson's病的病理生理学及临床特征

Wilson's病是一种较少见的常染色体隐性遗传的铜代谢疾病。由于铜转运基因 ATP7B发生突变而导致了肝的铜分泌失衡 ,铜元素在肝、脑和其他组织中蓄积导致了较广泛的肝、神经、精神和其他临床症状 。

不同mRNA差异显示法筛选胃癌细胞耐药相关基因的研究

目的 比较银染和放射自显影mRNA差异展示方法在分离、克隆胃癌细胞耐药相关基因过程中的优缺点。方法 长春新硷诱导人胃癌SGC790 1细胞 ,建立稳定的耐药细胞亚系SGC790 1/VCR。同时应用银染和放射自显影的mRNA差异展示方法筛选胃癌SGC790 1细胞和耐药细胞亚系SGC790 1/VCR之间mRNA表达的差异。结果 显示银染法省时 ,花费少 ,操作方便 ;在获得差异条带方面放射自显影法明显优于银染法 ,且其能得到较多低丰度的差异表达基因 ;而两者在二次PCR扩增 ,克隆 ,测序 ,杂交鉴定及假阳性率方面无明显差异。结论 银染mRNA差异展示法适合于高丰度差异表达基因的快速筛选 。

人核糖体蛋白S13(RPS13)编码基因的克隆及其正反义核酸转染胃癌细胞的初步研究

目的:扩增人核糖体蛋白S13(RPS13)编码基因序列,构建其正、反义真核表达载体,分别转染胃癌细胞SGC7901及胃癌耐药细胞SGC7901/VCR,以进一步研究RPS13基因与胃癌多药耐药的关系。方法:采用RT-PCR法扩增RPS13cDNA片段编码区全长序列,利用DNA重组技术构建正、反义真核表达载体,经脂质体介导转染胃癌细胞SGC7901及胃癌耐药细胞SGC7901/VCR,筛选正、反义基因稳定转染细胞,RNA斑点杂交法检测正、反义稳定转染细胞mRNA水平的变化。结果:从高表达RPS13的SGC7901/VCR耐药细胞中提取细胞总RNA,RT-PCR法成功扩增了RPS13cDNA片段编码区全长序列,并经测序证实;目的基因按正、反两个方向亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),并经酶切鉴定证实;经脂质体介导将正义真核表达载体转染SGC7901细胞,反义真核表达载体转染SGC7901/VCR细胞,G418筛选获得稳定转染细胞;RNA斑点杂交试验证实:正义稳定转染细胞RPS13mRNA水平上调,反义稳定转染细胞RPS13mRNA水平下调。结论:成功克隆了人RPS13编码基因序列,并构建了其正、反义真核表达载体。在胃癌细胞系SGC7901及长春新碱耐药细胞SGC7901/VCR中得到稳定转染细胞株,正义转染细胞中RPS13mRNA表达明显增加,反义转染细胞中表达明显受抑。

胃癌耐药相关抗体MGr1筛选文库获得的基因MGr1-Ag1在胃癌组织中表达的研究

目的:为研究肿瘤的多药耐药现象,应用胃癌耐药相关的单克隆抗体MGr1筛选肿瘤耐药细胞表达文库获得的一个稳定阳性克隆的cDNA片段MGr1-Ag1,检测MGr1-Ag1在胃癌组织中的分布及表达水平.方法:利用原位杂交技术,对MGr1-Ag1mRNA在胃癌组织中的分布进行了检测,以了解其在胃癌中的表达情况及意义.结果:MGr1-Ag1mRNA定位在胃腺体细胞的胞质中,为蓝色小颗粒,呈弥漫性分布.MGr1-Ag1mRNA在SGC7901/VCR阳性信号明显高于SGC7901,胃癌与癌旁组织相比,MGr1-Ag1mRNA的阳性表达率均有显著差异(P<0.05).MGr1-Ag1mRNA在胃癌(50.00%)、癌旁组织(71.42%)、高分化腺癌(68.75%)和中分化腺癌组织(57.14%)中的阳性表达率无显著差别,但高分化组和中分化组都与低分化腺癌组织(10.00%)差别显著(P<0.05).此外,MGr1-Ag1mRNA还分布于小肠及大肠腺体内,因例数偏少,未做统计.结论:MGr1-Ag1与胃癌的分化程度有关,随着组织的分化程度增高,MGr1-Ag1mRNA的阳性表达率增加.

mRNA差异显示研究胃癌相关基因

为了克隆与胃癌发病相关的新基因，我们以正常胃粘膜细胞ＧＥＳ和胃癌细胞系７９０１为对比材料，利用ｍＲＮＡ差异显示技术，得到两个ｃＤＮＡ片段。经分析发现，分别与Ｔｒｋ基因及白血病病毒基因有８０％和３０％的同源性及较好的读框，有可能为胃癌相关的新基因片段，已在ＧｅｎＢａｎｋ中登录：１７６１１６，１７６３８５。

PI3K/Akt途径在朊蛋白介导胃癌耐药中的作用研究

目的:探讨PI3K/Akt途径在朊蛋白(PrPc)介导胃癌耐药中的作用。方法:脂质体基因转染法建立高表达PrPc的胃癌细胞亚系。Western印迹检测转染细胞中Akt蛋白的表达。噻唑蓝(MTT)比色法测定单独或联用PI3K抑制剂LY294002时转染细胞对化疗药物的敏感性。流式细胞仪检测单独或联用LY294002时转染细胞内阿霉素蓄积和潴留。结果:将PrPc正义载体pcDNA-PrP转入SGC7901,成功建立PrPc高表达胃癌细胞亚系并命名为PS;空载体转染细胞命名为BS。Western-Blot显示磷酸化Akt在PS中的表达较BS及SGC7901增高,而三者的总Akt则无差别。未经LY294002处理时,在阿霉素或长春新碱的作用下,PS的存活率分别为91.4%±3.4%和89.4%±3.8%,较BS(79.2%±4.3%和75.9%±2.1%)明显增高(均),PS细胞内阿霉素蓄积量和潴留量分别为4.4±0.3和4.2±0.4,明显低于BS(8.2±0.5和8.0±0.3)(均);当联合LY294002处理后,PS在两种药物作用下的存活率均随着LY294002浓度的增加逐渐降低,并均在LY294002为30μmol/L时接近BS(均),PS细胞内阿霉素蓄积量和潴留量逐渐增高,并均在LY294002为30μmol/L时接近BS(均)。结论:PrPc介导的胃癌耐药与PI3K/Akt途径活性密切相关,抑制PI3K/Akt途径活性可逆转PrPc介导的胃癌耐药。

HSP90β在细胞中的表达水平与化疗敏感性的相关研究

目的了解胃癌细胞ＳＧＣ７９０１及其耐药细胞ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ中ＨＳＰ９０β蛋白的表达，与化疗药物敏感性的关系及降低细胞ＨＳＰ９０β蛋白的表达是否影响化疗药物的敏感性。方法用免疫组化法检测胃癌细胞ＳＧＣ７９０１及其耐药细胞ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ中ＨＳＰ９０β蛋白的表达。ＭＴＴ法测定ＳＧＣ７９０１、ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ细胞及其相应的ＨＳＰ９０β蛋白低表达细胞ＡＨ－ＳＧＣ７９０１和ＡＨ－ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ对化疗药物的敏感性，流式细胞仪测定细胞内药物含量。结果ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ细胞ＨＳＰ９０β蛋白的表达高于ＳＧＣ７９０１细胞。ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ细胞对ＡＤＭ、ＶＣＲ、ＭＭＣ和ＣＴＸ的ＩＣ５０分别为０．３９８、１．２５、０．１９９和３ ９８１．０７μｇ／ｍｌ。ＳＧＣ７９０１对ＡＤＭ、ＶＣＲ、ＭＭＣ及ＣＴＸ的ＩＣ５０分别为１．５８×１０－６、１．９９×１０－３、３．１×１０－２及６３０μｇ／ｍｌ。ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ相对于ＳＧＣ７９０１细胞对ＡＤＭ、ＶＣＲ、ＭＭＣ和ＣＴＸ的耐药指数分别为２．５２×１０５、６．２８×１０２、６．４２和６．３２。