RNA干扰基因敲除MAGE-1在恶性胶质瘤U87细胞中的初步研究

目的:通过构建抑制MAGE-1的短片段双链核糖核酸(siRNA)表达载体,鉴定其在人恶性胶质瘤细胞U87细胞中对MAGE1基因表达的干涉作用。方法:化学合成2对编码短发夹RNA序列的靶向MAGE1基因核苷酸链,克隆至经BglⅡ、HindⅢ双酶切的pSUPER载体上,重组构建核糖核酸干扰(RNAi)质粒载体。利RTPCR、流式细胞术和荧光显微镜,检测经稳定转染后胶质瘤U87细胞中MAGE-1的表达,以了解siRNA的干效果。结果:重组构建的pSUPERMAGE1载体经双酶切、电泳及插入基因片段序列分析,表明寡核苷酸链成地插入至预计位点,且序列与预期完全一致。稳定转染后G418筛选出的U87多克隆细胞MAGE-1的表达RTPCR、流式细胞术和荧光显微镜检测,2对siRNA均有较明显的干扰作用。结论:载体的成功构建并能对U细胞中的MAGE1分子进行RNAi,为进一步研究MAGE1在肿瘤中的作用,分析基因功能,展开肿瘤基因治疗奠了基础。

巨噬细胞诱发的增殖性玻璃体视网膜病变视网膜内的炎性细胞因子

目的检测增殖性玻璃体视网膜病变（PVR）发生过程中炎性细胞因子在视网膜内的含量变化。方法用同种巨噬细胞诱发免眼PVR，在不同时间点对全层眼组织切片中的TNF－α、IL－1β、IL－8和IL－6进行间接免疫荧光染色，并对其含量变化进行半定量分析。结果此模型1周时，视网膜色素上皮（RPE）胞浆内见极弱荧光绿色（±）；2周时，RPE胞浆内弥散暗荧光绿（＋）；3周RPE胞浆亮绿荧光染色（＋＋），视网膜杆锥层外1／3亦是阳性反应；4周RPE、视杆视锥外2／3呈明亮绿荧光（＋＋＋）。结论四种炎性细胞因子在PVR模型的视网膜组织内含量随自然病程而改变，提示它们在局部病程可能有调控作用。

KN-93对缺血再灌注后PC12细胞NF-κB表达及细胞活性的影响

目的 观察Ca2+ /钙调蛋白依赖性激酶Ⅱ(Ca2+ /CaMPKⅡ)竞争性抑制剂KN- 93对缺血再灌注损伤后大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12)核因子κB(NF- κB)的表达及细胞活性的影响情况。方法 将传代培养的PC12细胞在特制的装置中进行缺血再灌注处理,建立研究所需要的细胞模型并施以KN- 93进行干预,运用免疫细胞化学和流式细胞仪技术检测不同处理条件下NF- κB的表达情况,并应用甲基噻唑蓝(MMT)比色法对细胞的损伤程度进行检测。结果 经过KN 93预处理的试验组相对于单纯缺血再灌注处理对照组,NF- κB的表达和细胞损伤程度均明显降低(P<0. 01 )。结论 KN 93能够减少缺血再灌注引起的胞浆PC12细胞NF -κB的上调,并能减轻细胞的损伤程度;缺血再灌注损伤中NF κB的激活可能存在着Ca2+ /CaMPKⅡ调控通路。

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体在外周血单个核细胞中的表达

目的 :研究肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 (TRAIL)在外周血单个核细胞 (PBMC)中的表达及其意义。方法 :用免疫组织化学的方法检测PBMC中TRAIL的表达情况。结果 :淋巴细胞分离液得到的PBMC中 ,淋巴细胞占 (97.4 8± 3.4 3) % ,单核细胞占 (3.15± 0 .83) % ,TRAIL免疫反应阳性的淋巴细胞占总数的 (2 6 .31± 3.18) % ,呈TRAIL免疫反应阳性的单核细胞占总数的(1.0 4± 0 .13) % ,TRAIL免疫反应阳性物质分布于胞质内 ,核呈阴性反应。结论 :正常人外周血分离的淋巴细胞及单核细胞有TRAIL表达。

针对MAGE-1的pSUPERRNAi系统的构建

目的构建抑制MAGE-1的siRNA表达载体。方法化学合成2对编码短发夹RNA序列的、靶向MAGE-1基因的寡核苷酸链,各64个碱基,退火,克隆到经BglⅠ、HindⅢ双酶切的pSUPER载体上,重组构建RNAi质粒。通过双酶切鉴定及基因片段序列分析验证构建效果。结果重组构建的pSUPER-MAGE-1载体经双酶切电泳分析及插入基因片段序列分析,结果表明64个碱基成功插入到预计位点,并且序列完全一致。结论载体的成功构建,为进一步研究MAGE-1在肿瘤中的功能打下基础,可用于分析基因功能、肿瘤治疗等。

烫伤后抗生素应用时机与感染关系的实验研究

用白色雄性家兔45只,制成15%Ⅲ度烫伤后绿脓杆菌(PA)感染模型,分为预防、治疗和对照组三组。伤后立即静脉注射头孢哌酮(CPZ)组(预防组),在伤后1周内创面结痂、干燥,免疫荧光抗体染色见 PA 仅位于焦痂浅层;而第48小时开始静脉注射 CPZ 组(治疗组),则在伤后第3、4天 PA即侵入焦痂深层肌组织。血液细菌培养阳性率和动物病死率后者明显高于前者,且与对照组结果相同。这提示严重烧(烫)伤后必须在渗出早期全身应用广谱优效的抗生素,以便在痂下细胞外液中形成抗生素保护屏障,才能有效地防止创面细菌的侵袭性感染。