人高迁移率族蛋白1诱导血管内皮细胞肿瘤坏死因子α的分泌规律

目的 :探讨人高迁移率族蛋白 1(HMGB1)诱导血管内皮细胞肿瘤坏死因子α(TNF α)的分泌规律及其在脓毒症中的作用。 方法 :HMGB1的剂量效应组分别用含有 0、0 .1mg/L、1.0mg/L、10mg/L、2 0mg/L、5 0mg/LHMGB1的培养液与人脐静脉内皮细胞株ECV 30 4共培养 10h ,分别收取HMGB1刺激孔及对照孔细胞和培养液上清 ,用双抗体夹心ELISA法测其上清中的TNF α含量 ,采用流式细胞技术观察HMGB1诱导血管内皮细胞的凋亡情况。人HMGB1的时间效应组以含有 2 0mg/LHMG1的培养液、阳性对照组以含有 10 0mg/L脂多糖 (LPS)的培养液、阴性对照组以不含HMGB1的培养液分别培养EVC 30 4细胞 0、2、4、6、8、10、12和 2 4h ,同上留取离心后的培养液上清用双抗体夹心ELISA法测其上清中的TNF α含量。 结果 :将HMGB1加入到血管内皮细胞培养液中能明显刺激其TNF α的分泌。在 0 .1～ 5 0mg/L范围内 ,HMGB1诱导EVC 30 4的TNF α分泌增加 ,呈明显的剂量依赖性关系 ;HMGB1组EVC 30 4的TNF α分泌在 0～ 2 4h间呈时间依赖性关系 ;5 0mg/LHMGB1能明显诱导EVC 30 4细胞凋亡。 结论 :人HMGB1能诱导血管内皮细胞TNF α的分泌与凋亡 ,证实HMGB1在脓毒症的发生、发展中发挥作用。

HMGB1B盒编码序列的克隆和大肠杆菌表达

目的:克隆小鼠高迁移率族蛋白1(highmobility groupbox1,HMGB1)B盒编码序列并在大肠杆菌中表达GST B盒融合蛋白.方法:从新生小鼠肺组织提取总RNA,经RT PCR获得HMGB1B盒编码序列.将酶切后PCR产物克隆到 pGEX 4T 2载体的BamHI和EcoRI位点之间,经双酶切鉴定 后测序证实.用pGEX 4T 2 B转化BL21(DE3)感受态细胞,在30℃经IPTG诱导表达5h后进行SDS PAGE分析.结果: 测序结果证实成功获得了小鼠HMGB1B盒编码序列,其序列 与GenBank中报道序列完全一致.SDS PAGE分析表明,在大 肠杆菌BL21(DE3)中高效表达了GST B盒蛋白,表达量约占 菌体总蛋白的30%,结论:成功克隆小鼠HMGB1B盒编码序 列并在大肠杆菌中获得了高效表达.

人HMGB1基因的原核表达、产物纯化及活性鉴定

目的 构建人高迁移率族蛋白 1(HMGB1)编码基因的表达载体 ,获得纯化的重组蛋白 ,研究其生物学功能。方法 通过RT PCR方法扩增出人HMGB1的编码基因 ,克隆于载体pGEM Teasy,再亚克隆于表达载体pGEX4T 2 ,经IPTG诱导可表达相对分子质量 (Mr)约 5 6× 10 3的融合蛋白GST HMGB1。经用GSTrapFF蛋白纯化柱和凝血酶行柱上酶切 ,得到纯化的重组蛋白HMGB1,用培养的人单核细胞系THP1检测蛋白活性。结果 构建了融合蛋白GST HMGB1的重组表达质粒 ,获得了Mr 约为 30× 10 3的纯化蛋白产物。该蛋白能刺激THP1细胞产生TNF α ,并能明显诱导THP1细胞的凋亡。结论 获得了纯化的人HMGB1原核表达产物 ,对研究其在脓毒症中的生物学功能具有重要的意义。