基因组深度挖掘驱动微生物萜类化合物高效发现

萜类天然产物广泛分布于动物(包括海洋无脊椎动物)、植物、微生物中,具有复杂的化学结构和丰富的生物活性。人们通过从植物和微生物中直接分离提取的方式获得了大量萜类天然产物,然而随着越来越多化合物被发现,使用基于自然筛选的传统挖掘方式很难获得新的萜类天然产物。随着基因组测序技术和合成生物学使能技术的不断发展,我们进入了基因组挖掘驱动天然产物发现的时代,萜类天然产物的挖掘也进入了“井喷式”发现新阶段。针对基因组挖掘在微生物萜类天然产物发现方面的应用,本文综述了近年来使用的主要研究策略和最新研究进展,介绍了多种高效微生物底盘、基因组深度挖掘策略、人工智能与自动化平台等驱动的萜类化合物挖掘的最新研究进展,讨论了基因组挖掘萜类天然产物面临的挑战,展望了未来萜类化合物创新发现的发展趋势。通过在多种微生物中强化前体供应途径,人们打造了多个萜类化合物合成底盘,突破了异源合成萜类天然产物时“产量低”和“产物难获取”的瓶颈;针对萜类天然产物生物合成基因簇或萜类合酶进行深度挖掘,可以有效地解决“重复发现”和“集中度低”的难题;随着人工智能和自动化技术在合成生物学领域的发展和应用,萜类化合物的发现也进入了高通量智能发现时期,显著地改善了“研究通量低”的现状,高效获得了大量新结构萜类天然产物。在未来,更多萜类化合物将开发成药物、进入工业化生产应用,更多萜类“暗物质”会走进我们视野。

萜类化合物的非常规生物合成研究进展

萜类化合物是自然界中广泛存在的一类具有重要生理功能和显著生物活性的天然产物,在食品、医疗及日化行业有着广泛的应用。在萜类化合物的生物合成途径中,萜类合酶往往决定了萜类碳骨架的种类和结构新颖性,细胞色素P450酶等后修饰酶则可对碳骨架进行多种修饰,最终形成结构和功能都具有丰富多样性的萜类化合物。近年来,随着基因测序技术与合成生物学的发展,大量植物和微生物来源的萜类生物合成酶被表征,令人兴奋的是,其中包含一些与经典萜类合酶不同的非常规萜类合酶,它们亦可催化生成独特的环化萜类骨架。与此同时,利用组合生物合成等策略,人们创造了许多新颖的非天然萜类化合物,进一步丰富了萜类资源库。本文综述了近5年在非常规萜类环化酶与组合生物合成途径等方面取得的最新研究进展,以期为未来新型萜类化合物的发现和生物合成提供启示。本文首先综述了新发现的具有萜类环化功能的新酶,包含Ⅰ型萜类合酶新亚族、非角鲨烯来源三萜合酶、UbiA型萜类环化酶、细胞色素P450氧化酶、甲基转移酶、钒依赖卤素过氧化物酶、卤代酸脱卤酶等,同时还对其序列、功能和可能的环化机制进行了介绍,有助于理解自然界中萜类生物合成酶的进化起源和发现新颖萜类化合物。然后,本文介绍了非常规萜类衍生物的组合生物合成,通过将萜类合酶与甲基转移酶、天然或人工细胞色素P450氧化酶进行组合,产生了一系列包含非常规C_(11)、C_(16)骨架以及具有不同氧化形式的非天然萜类化合物,可为往后萜类化合物的结构创新研究带来启发。这些新颖酶元件的挖掘与新型组合生物合成途径的构建,将进一步拓宽萜类化合物的结构多样性和化学空间,有望为临床萜类药物研发提供更多的潜在小分子。

以组合生物合成策略为导向的C-核苷类多氧霉素的研究

基于组合生物合成策略,成功地将马来亚霉素结构中的C-核苷引入多氧霉素结构中,合成了具有C-核苷的新型多氧霉素杂合抗生素。这一过程包括通过人工设计杂合抗生素的结构,改造多氧霉素的工业菌株金产色链霉菌,并获得相应的突变菌株;接着,整合负责C-核苷合成的起始基因truD和malO,得到重组菌株PA1和PA2。通过生物活性测定和液相高分辨质谱(LC-HRMS)分析,对代谢产物进行了结构确证。此外,为了提高目标杂合抗生素的产量,增加了多氧霉素生物合成基因簇的拷贝数,获得了重组菌株PA3。重组菌株PA1和PA2能够定向产生具有C-核苷结构的假尿苷多氧霉素L(ψ-polyoxin L)和假尿苷多氧霉素K(ψ-polyoxin K)。通过基因簇加倍的策略,重组菌株PA3的ψ-polyoxin L和ψ-polyoxin K的产量均显著提高。这一新型C-核苷类多氧霉素的合成为今后相关核苷类抗生素多重组合生物的研究奠定了坚实的基础。

碱基编辑技术及其在微生物合成生物学中的应用

CRISPR/Cas系统的发现与发展对生命科学领域产生了革命性的影响,借助CRISPR/Cas系统研发出的一系列工具为相关领域的研究带来了极大的便利。碱基编辑器便是其中一类基于CRISPR/Cas系统开发的可实现碱基转换和颠换的基因编辑工具,其通过将胞苷或腺苷脱氨酶以及其他功能元件与失去双链切割活性的Cas蛋白相融合,由sgRNA引导,实现对基因组上目标位置胞嘧啶或腺嘌呤的碱基转换。碱基编辑器一经开发便在生物学、医学等领域展现出巨大的应用潜力,虽然经过不断优化,但目前在使用时仍然存在着许多制约因素。本文简述了几种主要碱基编辑器的发展,并介绍了碱基编辑器存在的靶向范围受限和脱靶编辑的问题以及现有的优化措施。同时列举了我国部分科研工作者将碱基编辑技术运用于微生物合成生物学领域的进展,并展望了碱基编辑技术的发展及其在微生物合成生物学领域的应用前景。

抗生素生物合成基因簇克隆策略的研究进展

抗生素是一类具有多种生物活性的微生物次级代谢产物,自然界中60%以上的抗生素由放线菌所产生。克隆抗生素生物合成基因簇可为阐明其生物合成机制,结构改造,产量提高提供重要信息。在后基因组时代,新的抗生素基因簇克隆策略不断涌现,大大提高了微生物重要次级代谢产物生物合成基因簇的克隆效率,并缩短了抗生素的发现周期。本文综述了抗生素生物合成基因簇克隆策略的研究进展,包括近年来发展的后基因组的克隆策略。

米贝链霉菌DSM41911的米尔贝霉素生物合成的初步研究

对米贝链霉菌DSM41911进行初步研究,通过对16S rRNA及相关功能基因序列进行生物信息学分析,表明米贝链霉菌DSM41911与冰城链霉菌具有较高同源性。设计16种固体和液体培养基对菌株的发酵条件进行筛选,在MB4、MB6培养基中成功检测到milbemycin B5、milbemycin E、milbemycin VM44864和milbemycin B1。参考近似菌株冰城链霉菌的合成基因并结合文献推测出米尔贝霉素在米贝链霉菌DSM41911中的合成途径,为后续高产菌株的筛选提供参考。

微生物药物的合成生物学研究进展

微生物天然产物一直都是新型生物药物创新的主要源泉,是目前开发临床抗菌、抗肿瘤、免疫抑制剂等药物的重要资源。随着临床耐药菌的日益增多,新型病原菌和病毒的不断出现,以及新骨架天然产物挖掘难度的增加,新型微生物药物的开发正面临着巨大挑战。作为21世纪生命医学领域催动原创突破和学科交叉融合的前沿学科,合成生物学的崛起为解决药物研发困境提供了新的思路和方法,它可以突破天然药物发现的瓶颈,设计新的生物合成途径,产生更多天然药物及类似物。本文综述了近五年来合成生物学在微生物药物研究领域的技术革新,及其在氨基糖苷类抗生素、核苷类抗生素、核糖体肽、萜类以及聚酮类化合物等5大类微生物天然药物的发掘、生物合成以及新结构创制等方面的应用。

合成微生物技术促进类胡萝卜素产品的高效合成

类胡萝卜素是一类重要的天然色素,因其具有多种生物功效,应用非常广泛。首先对类胡萝卜素的天然合成途径进行了介绍,总结了类胡萝卜素相关产品应用及目前的生产方式,着重介绍了番茄红素、β-胡萝卜素和虾青素等产品微生物发酵法的制备方法在菌株和途径构建上的最新研究成果。重点对类胡萝卜素生物合成产业化面临的主要问题进行了分析讨论,并提出一些建议供相关产业进行参考。

微生物药物合成的放线菌底盘

合成生物学作为一门新的工程科学已然成为全世界关注的焦点。与传统的研究手段不同，合成生物学以工程化的思想引导人们有针对性地设计、制造各种元件和体系，将多样的“生物砖”按“设计图”组装并在适当的底盘体系中有效地生产造福人类的新药物、化学制品和燃料等，以解决现在所面临的健康、能源、材料、环保等问题。文章简述了合成生物学的三大飞跃进展、生物底盘构建的研究进展以及放线菌底盘在微生物药物合成方面的研究进展。

罗米地辛类抗癌药物的生物合成

罗米地辛(又称FK228)是紫色色杆菌中非核糖体肽合酶(NRPS)和I型聚酮合酶(PKS)催化合成的一种缩酚酸肽类天然产物,具有组蛋白脱乙酰基酶抑制剂活性,现被用于皮肤T细胞淋巴瘤和外周T细胞淋巴瘤的临床治疗。我们对已发现的罗米地辛类天然产物的化学结构,生物合成基因簇和生物合成途径的研究现状进行了总结,在此基础上初步探讨了通过基因组挖掘和组合生物合成等生物学手段获取新的罗米地辛类天然产物的可能性。

基于网络药理学对鹿蹄橐吾镇咳活性成分的初步研究

目的:采用网络药理学方法获取鹿蹄橐吾治疗咳嗽的潜在活性成分及蛋白靶点,并探讨可能的作用机制。方法:从PubMed等数据平台获得鹿蹄橐吾化学成分并使用SwissADME和SwissTargetprediction对其进行筛选,获取潜在成分;利用GeneCards获取咳嗽相关靶点;通过STRING和Cytoscape构建和分析PPI网络,获取核心靶点;使用Metascape平台进行GO生物功能过程和KEGG代谢通路富集分析。结果:在多平台分析下得到23个核心靶点,其对应成分中多为艾里莫芬烷型倍半萜,GO分析获取了如蛋白磷酸化正调控、炎症反应调节等生物过程,细胞膜及突触等细胞组成,以及蛋白激酶结合、蛋白质结构域特异性结合等分子功能条目。KEGG富集显示与炎症等相关的信号通路。结论:鹿蹄橐吾存在改善咳嗽病征的有效成分,且以多组分、多靶点、多通路的形式发挥作用,其机制可能涉及炎症和免疫等相关通路。

遗传改造微生物代谢途径生产新型柴油燃料的研究进展

生物柴油是一种能替代柴油的可再生燃料,然而通过植物油料化学转酯化生产的第一代生物柴油在性能和生产工艺上有很多缺点。近年来随着合成生物学和代谢工程的迅速发展,通过选择合适的微生物并利用各种生物技术改造其代谢合成途径,如脂肪酸合成途径、异戊二烯合成途径,研究人员能利用微生物直接生产性能更加优越、品质更高的新型第二代生物柴油——长链烷烃。文章总结了目前遗传改造微生物代谢途径生产新型柴油的研究进展,并指出目前该领域存在的问题以及今后的发展方向。

脂肪酶催化微藻油脂制备生物柴油的工艺研究

以商业固定化脂肪酶复配的组合酶(米黑毛霉脂肪酶+南极假丝酵母脂肪酶)为催化剂、栅藻藻油为原料制备生物柴油,对反应体系和条件进行全面优化,得出最理想的酶催化反应体系和条件分别为:藻油与甲醇摩尔比为1∶12、助溶剂(叔丁醇)∶藻油为1∶1(V/m)、藻油与固定化脂肪酶质量比为50∶1、反应温度为45℃、反应时间为9~12 h、摇床转速为250 r/min。在此条件下,制得的生物柴油(FAME)最高转化率达98.67%,为微藻生物柴油的工业化开发和应用提供了参考依据。

盐酸左布诺洛尔的合成工艺改进

以回收的盐酸左布诺洛尔废料为原料,经NaOH碱化,HBr水解得5-羟基-α-萘满酮(2);2经醚化、氨化、用右旋酒石酸拆分得到盐酸左布诺洛尔,其结构经1H NMR和IR确证。2的回收率90%,总收率80.6%。

利用腺苷脱氨酶催化formycin A高效合成formycin B

Nocardia interforma ATCC 21072和Streptomyces kaniharaensis ATCC 21070是formycin A(FOR-A)的产生菌株,ADA3则为来自Streptomyces antibioticus NRRL 3238中的腺苷脱氨酶(adenosine deaminase,ADA),具有广泛的底物特异性。本研究以ADA3为探针,通过生物信息学找出N.interforma和S.kaniharaensis基因组中同源蛋白NiADA(N.interforma中的ADA)和SkADA(S.kaniharaensis中的ADA)。将SkADA密码子优化后,成功实现了二者在大肠杆菌中的可溶性表达,进一步的酶促反应分析显示,二者对腺苷与FOR-A具有显著的脱氨活性(催化腺苷和FOR-A分别形成肌苷和FOR-B),相关酶学研究为今后的酶促反应制备肌苷类似物奠定了理论基础与实践依据。

研究型大学本科生生物技术制药课程的教学改革与实践

为满足社会对生物技术药物需求的日益增长和生物制药学科发展的自身需要,生物技术制药课程的改革显得非常必须和重要。本文总结了武汉大学生物技术制药课程授课内容、授课方式和考核方式的改革与实践经验。此体系能够促成学生生物技术与药学知识的融会贯通,促进学生创新精神和创造能力的培养。

庆大霉素及其相关产物在工业底盘细胞中的高效合成

庆大霉素是一种氨基糖苷类抗生素,在临床上广泛应用于治疗由革兰氏阴性菌引起的严重感染。它可由棘孢小单孢菌Micromonospora echinospora产生,生物合成途径清晰。为了提高庆大霉素的产量,本文以工业菌株M.echinospora J1-020为基础,确定庆大霉素合成基因簇信息,建立了稳定的遗传操作方法。在此基础上,使用强(kasOp*)、中(rpsLp-cf)、弱(ermE*)三种强度的启动子评估磷酸转移酶GenP的最适过表达水平,构建对应attB/attP位点整合突变株YC002、YC003、YC001。摇瓶发酵结果显示,YC001、YC002、YC003菌株的庆大霉素C组分的产量较原始菌株[(1008±57)mg/L]分别提高了16.9%[(1178±39)mg/L]、30.8%[(1319±29)mg/L]和18.8%[(1198±46)mg/L];同时,结合杂质含量,在以上三株菌株中确定了中强度启动子控制genP过表达的效果最佳,以此构建对应的稳定整合在基因组上的genP过表达菌株YC004。使得庆大霉素C组分摇瓶发酵产量提高了34.5%[(1427±37)mg/L]。此外,以工业菌株M.echinospora J1-020为底盘,构建genQ敲除菌株,获得了只产生G418单一组分的菌株YC005,其摇瓶发酵产量为460 mg/L。以YC004为出发菌株,依次敲除genB4、genK,获得了只产生西索米星单一组分的菌株YC007,其摇瓶发酵产量达1046 mg/L。综上,以该工业菌株M.echinospora J1-020为底盘,借助合理的代谢工程策略有望快速获得多种氨基糖苷类抗生素的高产菌株。

麦角硫因在游动放线菌底盘中的高效合成

【目的】麦角硫因是一种稀有的天然氨基酸类强抗氧化剂,在机体内发挥着重要的生理功能,并在食品、医药、化妆品领域得到广泛应用。然而,传统的从蕈菇中提取和化学合成的方法存在收率低、成本高等问题,本研究期望利用代谢工程改造,提高游动放线菌(Actinoplanes sp.)HS中麦角硫因的产量。【方法】首先通过生物信息学分析,锁定了Actinoplanes sp.HS中可能参与麦角硫因合成的基因;接着在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中进行异源表达,进一步鉴定了这些基因的功能;最后将鉴定功能的基因组合后在Actinoplanes sp.HS中进行高表达,对突变株产量进行测定,并通过在发酵培养基中添加不同浓度的前体,探究其对发酵产量的影响。【结果】Actinoplanes sp.HS中基因BC03-04016、BC03-04015、BC03-04014、BC03-04013所编码的酶可以合成麦角硫因前体组氨酸甜菜碱半胱氨酸亚砜(hercynine-cysteine-sulphoxide,HER-Cys-Sul),基因BC03-04046和BC03-04917所编码的酶都具有裂解碳硫键的功能,可以催化前体HER-Cys-Sul形成终产物麦角硫因。将编码麦角硫因合成的基因高表达后得到的突变株YC313和YC314,其麦角硫因产量分别达到125 mg/L和108 mg/L,较出发菌株Actinoplanes sp.HS分别提高至2.9倍和2.5倍。在发酵培养基中额外添加0.35 g/L的甲硫氨酸后,YC313菌株的麦角硫因产量相较于原始培养基提高了24%;额外添加10 g/L的黄豆饼粉后,相较于原始培养基麦角硫因产量提高了19%。【结论】本研究对Actinoplanes sp.HS中麦角硫因合成的相关基因及其功能进行了鉴定,通过代谢工程改造得到了两株麦角硫因高产菌株,并进一步研究了前体供应对麦角硫因产量的影响,为以游动放线菌为底盘生产麦角硫因提供了策略支持。

茯苓总三萜对小鼠肝损伤的预防作用

目的:研究茯苓三萜对四氯化碳(CCl4)所致小鼠肝损伤的治疗作用。方法:将小鼠随机分为正常组、模型组、联苯双酯组及茯苓三萜高、中、低剂量组共6组。小鼠腹腔注射CCl4橄榄油溶液造模。治疗组以高、中、低剂量(180、90、45mg/(kg.d))茯苓三萜进行灌胃,阳性药物对照组用联苯双酯滴丸(180mg/(kg.d)),皆以1g/100mL羧甲基纤维素钠溶液混悬,0.2mL/10g体质量进行灌胃;正常组与模型组以0.9%生理盐水(0.2mL/10g)体质量灌胃。最后摘眼球取血,收集血清,检测丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)活性;以及小鼠肝组织HE染色后做病理切片观察。结果:与模型组相比茯苓三萜治疗组能够显著降低小鼠血清中AST、ALT活性。病理切片清楚地显示茯苓三萜能够显著减轻小鼠肝损伤的程度。结论:茯苓三萜对CCl4所致的小鼠肝损伤有明显治疗作用。

N-三甲基壳聚糖包衣PLGA纳米粒疫苗载药系统增加抗原交叉递呈的初步研究

目的:探讨N-三甲基壳聚糖包衣聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA]纳米粒对诱导树突细胞交叉递呈的机制。方法:复乳法制备PLGA纳米粒并用N-三甲基壳聚糖(N-trimethyl chitosan,TMC60)进行包衣,分别包载模型抗原卵清白蛋白、异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的卵清白蛋白(FITC-OVA)。将TMC60包衣和未包衣的纳米粒分别作用于体外培养的小鼠骨髓系树突细胞(murine bone marrow-derived dendritic cell,BMDC),用流式细胞仪检测BMDC对纳米粒子的吞噬动力学及BMDC表面分子CD83,MHCI和MHCII的表达;B3Z T细胞检测纳米粒被BMDC摄取后引起的交叉递呈反应。结果:TMC60包衣PLGA纳米粒可以促进BMDC吞噬作用;促进BMDC表达表面分子CD83和MHC I;增强BMDC对纳米粒包载抗原的交叉递呈作用。结论:TMC60包衣PLGA纳米粒可增强BMDC对外源性抗原的摄取及交叉递呈作用。