“软骨组织工程种子细胞的研究进展”点评

种子细胞来源问题一直是限制软骨组织工程进一步发展的重要瓶颈。尽管各类软骨细胞、成体干细胞、多能干细胞等在软骨再生领域均获得了较大进展,但要实现临床应用转化仍面临诸多挑战。该文重点综述了不同来源种子的特性、其在软骨组织工程中的研究进展、临床转化面临的难题及未来的研究方向,这为组织工程技术的发展提供了重要参考。

负载姜黄素支架体内构建组织工程软骨的可行性研究

目的探索以负载姜黄素材料为支架,在动物皮下构建组织工程软骨的可行性。方法通过细胞划痕试验明确既可抑制血管但又不影响干细胞生物活性的姜黄素的最佳浓度范围。负载姜黄素的支架材料与单纯明胶支架材料分别植入裸鼠皮下,术后3、6周取材,比较局部皮下血管抑制程度。软骨细胞-负载姜黄素支架复合物与软骨细胞-明胶支架复合物分别植入裸鼠皮下,术后3、6周取材进行组织学检测,比较软骨形成情况。结果姜黄素对h UVEC的有效抑制浓度为30μmol/L,而对BMSC的有效抑制浓度为40μmol/L。负载姜黄素支架在裸鼠皮下具有明显的血管抑制作用。软骨细胞-负载姜黄素支架复合物在裸鼠皮下可形成成熟软骨。结论负载姜黄素支架具有血管抑制作用且不影响软骨再生,有望成为软骨再生的理想支架。

脂肪干细胞在骨组织工程中的应用进展

骨组织的缺损是临床上常见的外科疾病之一。目前临床上大多采用自体移植、异体移植以及人工合成替代品移植技术来修复这些缺损，但这些方法各有其缺点，很难满足临床上修复这些缺损的需要。随着组织工程技术的迅速发展，为骨组织缺损的修复和功能性的重建提供了理想的方法。基于对骨组织创伤修复的雄厚的理论研究基础，骨组织工程处于组织构建与缺损修复的最前沿。根据美国组织工程与再生医学学会的全国性调查与统计，骨组织工程是最有可能率先进入临床应用的组织工程技术。

成骨微环境仿生支架用于骨组织工程的可行性分析

目的探索使用羟基磷灰石(HA)、脱钙骨基质(DBM)粉末及明胶(GT)制备成骨微环境仿生支架的可行性及其细胞相容性和成骨诱导活性。方法将骨组织粉碎后经脱脂、脱钙、脱细胞处理,并使用DNA定量检测DBM脱细胞效果,再将DBM粉末与一定比例羟基磷灰石及明胶一同制备成为成骨微环境仿生支架。比较不同浓度比例的HA-DBM-GT支架的孔径、孔隙率。取羊骨髓基质干细胞,接种于合适浓度比例的HA-DBM-GT支架,体外培养,于第1、3、7天进行大体、电镜观察,DNA定量及活死细胞染色;于第1、7、14天进行成骨分化相关基因检测。结果DNA定量显示脱钙骨基质粉末的制备过程可有效去除骨组织中的细胞;随着脱钙骨及羟基磷灰石比例的提高,支架孔径明显增大;各组HA-DBM-GT支架孔隙率均可达到84%以上;活死细胞染色及DNA定量证实细胞可在支架上黏附、增殖;qt-PCR检测证实支架材料可诱导干细胞特异性表达成骨基因。结论成功制备了一种成骨微环境仿生支架,并证实其具有良好的材料表征、细胞相容性及成骨诱导活性,可用于组织工程骨构建。

基于三维打印和组织工程技术构建人阴茎形态软骨支撑体

目的探讨基于三维打印和组织工程技术构建人阴茎形态软骨支撑体的可行性。方法应用三维打印技术制备人阴茎形态聚己内酯/羟基磷灰石(PCL/HA)内核,并在外层包被聚羟基乙酸/聚乳酸(PGA/PLA)细胞支架,组装成人阴茎形态三维复合支架。获取乳猪关节软骨细胞,培养、扩增至第1代,收取细胞,接种至复合支架,体外培养4周后植入裸鼠皮下,体内8周后取材,进行大体及组织学观察。结果人阴茎形态复合支架形态逼真,植入裸鼠体内8周后,再生出人阴茎形态的软骨支撑体,支撑体表面形成均质、成熟的软骨层,软骨层与内核支架融合良好。结论基于三维打印和组织工程技术,可形成内核为PCL/HA支架,外层包被成熟软骨的人阴茎形态软骨支撑体。

软骨脱细胞基质仿生支架体外构建组织工程软骨

目的探索软骨脱细胞基质(ACM)仿生支架体外构建组织工程软骨的可行性。方法将软骨组织彻底粉碎后脱细胞处理,复合一定比例的明胶(GT)制备三维多孔支架。分析比较不同ACM/GT比例多孔支架的孔径、孔隙率、生物力学和降解速率,选取最适宜软骨体外再生的一组多孔支架用于体外构建。获取、培养猪关节软骨细胞,接种于ACM多孔支架上,体外培养8周后,行大体观察及组织学检测。结果ACM多孔支架孔隙分布均匀,随ACM含量的增加,孔径和孔隙率逐渐增大,力学强度逐渐降低,其中,ACM:GT=5:5组在孔径和孔隙率方面均适宜体外软骨再生。大体观察和组织学检测显示,ACM支架可体外再生均质、典型的软骨组织。结论ACM可制成适宜软骨再生的三维多孔支架,并可体外构建组织工程软骨。

PLGA的不同组成对支架材料性能的影响研究

研究PLGA的不同组成对支架材料的力学性能、降解性能和生物学性能的影响。采用溶液浇注/颗粒沥取法制备出不同组成的PLGA多孔支架,对支架的力学性能和降解速率进行考察,同时将人真皮成纤维细胞接种于不同组成的PLGA支架材料上,培养不同时间后,检测细胞的粘附率和增殖率,以及细胞产生的总胶原含量,并通过扫描电镜观察支架上的细胞形态。结果显示,随PLA比例的增加,支架的力学强度增加,降解速率降低,但都不是线性变化。70∶30比例的支架,拉伸强度最高,而70∶30和80∶20两种比例的支架,其降解速率没有显著性差异。PLGA不同组成的支架,均具有良好的细胞相容性,成纤维细胞粘附率和增殖率在三种比例的支架上没有显著性差异,细胞在支架表面生长良好,分泌大量的细胞外基质,细胞基本铺满整个支架。研究发现,PLGA的组成对支架力学性能、降解性能和生物学性能有细小但显著的影响,这将对组织构建选用PLGA支架材料提供有益的帮助。

类胚体中残留未分化胚胎干细胞的初步研究

目的探讨类胚体中残留未分化胚胎干细胞(ESC)的特性。方法小鼠R1和Oct-4-GFP转基因ESC细胞株,体外类胚体分化20d后消化打散,重新给予ESC常规培养液培养。观察类胚体中残留未分化细胞形态;流式细胞仪和免疫荧光染色检测和观察残留细胞表面标志物及体外再次分化能力。将残留细胞扩增后注射入裸鼠背部皮下和大腿肌肉内,6周后注射部位取材进行大体和组织学检查。结果分化20d的类胚体中存在残留未分化ESC,生长形态呈克隆样,表达SSEA1、CD31、CD9和Oct-4等未分化ESC标志;细胞能反复传代,并可在体外再次分化和残留。残留细胞注射部位形成畸胎瘤,瘤体组织中存在成熟的内胚层、中胚层和外胚层组织。结论胚胎干细胞分化为类胚体后仍存在残留未分化全能ESC,残留细胞在体内、外可再次分化,并能在体外分化中再次残留。

镁黄长石浸提液影响人脂肪干细胞增殖和成骨分化的实验研究

目的通过探讨不同浓度镁黄长石浸提液对人脂肪干细胞(Human adipose-derived stem cells,hADSCs)增殖和成骨分化的影响,初步阐明镁黄长石体外促进hADSCs成骨分化的机制。方法依照ISO/EN 10993-5标准,制备镁黄长石浸提液,将获得的hADSCs培养于不同浓度的浸提液中(1/2、1/4、1/8、1/16、1/32),利用MTT法检测细胞的增殖情况;在成骨诱导条件下,通过碱性磷酸酶染色、活性检测和茜素红染色以及钙离子定量检测,观察不同浓度浸提液对hADSCs成骨特性的影响。结果 1/2、1/4、1/8浓度的浸提液可以浓度依赖性地抑制hADSCs的体外增殖;1/4、1/8、1/16浓度的浸提液可以促进hADSCs的体外成骨分化;碱性磷酸酶染色和活性检测、茜素红染色和钙离子定量检测显示,1/4浓度的浸提液对hADSCs的体外成骨分化促进作用最强,此时的钙、镁和硅离子浓度分别为:2.36 mM、1.11 mM和1.03 mM。结论镁黄长石浸提液中的离子在适当浓度时,可以抑制hADSCs的体外增殖,同时促进hADSCs的体外成骨分化。

骨髓基质干细胞扩增体系研究

目的比较三种不同培养体系对人骨髓基质干细胞（hBMSCs）增殖能力、表面标志和分化潜能的影响,探索hBMSCs适合的培养体系。方法获取hBMSCs,分别用DMEM、DMEM＋碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和无动物组份的间充质干细胞培养基（Mesenchymal Stem Cell Medium-animal component free,MSCM-acf）进行培养,反复传代至第6代,分别计数每种培养体系每个代次的细胞得率。取第4~6代细胞,用流式细胞仪对细胞表面标志进行检测,同时对各组第6代细胞分别向成软骨、成脂和成骨方向进行诱导分化。结果培养至第2代后,MSCM-acf培养体系细胞得率显著大于其他两组;流式细胞分析结果表明,MSCM-acf培养体系表面阳性标志CD73、CD90和CD105均大于99%,总的阴性标志表达小于2%,优于其他两组,尤其是DMEM＋bFGF培养体系;三组均保留了多向分化潜能,添加bFGF的培养体系成软骨分化明显优于其他两组,MSCM-acf培养体系成脂和成骨分化优于其他两组。结论 MSCM-acf培养体系可以实现hBMSCs干性维持下的大量扩增,是hBMSCs较为理想的培养体系。

低分子凝胶M2和交联透明质酸作为可注射性软骨再生支架的可行性研究

目的探讨以低分子量凝胶M2和交联透明质酸(Hyaluronic acid,HA)作为可注射性支架材料,在裸鼠体内构建组织工程软骨的可行性。方法常规分离、体外单层培养新生猪耳软骨细胞,将获得的软骨细胞以50×106 cells/m L和100×106cells/m L的浓度分别与M2凝胶混合,以100×106 cells/m L的浓度与交联HA混合,分别注射于裸鼠皮下,并于8周后取材。以单纯M2凝胶及单纯HA作为对照组。通过大体观察、组织化学检查、湿重测定、力学检测、蛋白聚糖(Glycosaminoglycan,GAG)含量测定,判断低分子量凝胶M2及交联透明质酸在体内形成软骨的能力。结果实验组3组均可形成软骨样组织块。其中,M2+高浓度细胞组体积最大、质地较硬、表面光滑,软骨细胞位于成熟的陷窝中;M2+低浓度细胞组形成与高浓度细胞组质地相似的组织块,但体积相对较小;HA组形成不成熟的组织块,硬度差,含有的细胞数和分泌的基质最少。同时,实验组3组的力学和GAG含量结果也证实M2+高浓度细胞形成的软骨更加成熟。各组间具有显著性差异。2个对照组未有类软骨组织形成。结论低分子凝胶M2与软骨细胞的生物相容性优于交联HA,更适合作为可注射性支架材料用于组织工程化软骨的构建。

软骨细胞膜片修复山羊气管的实验研究

目的探讨软骨细胞膜片技术构建的组织工程软骨,修复大型哺乳动物气管缺损的方法。方法取6头山羊耳廓软骨细胞为种子细胞,利用细胞膜片技术构建软骨组织。膜片体外培养6周,回植到动物腹部皮下;3例在皮下埋置8周后包裹于硅胶管上,移植到颈旁进行再血管化和塑形,8周后带肌肉蒂修复气道缺损(带蒂移植组);另3例在皮下埋置16周后,直接用于气道缺损修复(游离移植组)。动物气管缺损范围均为3个气管环长的全段缺损。结果所有膜片在体外培养6周后,均能形成较为成熟的软骨样组织。带蒂移植组在皮下埋置8周后能形成成熟软骨组织,移植到颈旁肌肉能成功再血管化和塑形。气管缺损修复术后,带蒂移植组均能带T型管长期存活(14周),但拔出T型管后均在2周内死亡。取材时发现,带蒂移植组修复段组织工程软骨仍然存活,并在相应部位维持了很好的管壁外形,但是没有软骨外壁的部位发生明显塌陷;内壁结缔组织增生严重,阻塞管腔。游离移植组在皮下埋置16周后,也形成了成熟软骨组织。移植修复后,在T型管存在的情况下,均在术后2周内死亡。取材发现,修复段气道均发生了严重的组织坏死感染,并波及周边组织;组织学观察仅能发现少数散在的组织工程软骨组织。结论软骨细胞膜片技术是稳定可靠的组织工程软骨构建方法;在气道复杂环境中,游离移植的软骨补片会在短时间内发生坏死;带蒂移植能保证修复段组织的存活,但是完整的软骨外壁和内壁提前(或尽快)上皮化是修复成功的关键。

组织器官衰老的“种子与土壤”理论

人口老龄化已经成为全球关注的焦点,如何减少衰老相关疾病的发生,是预防医学面临的重大挑战。建立科学的衰老理论,将为制定有效的抗衰老策略提供重要的依据。借鉴组织工程学的研究经验,我们提出了组织器官衰老的“种子与土壤”理论:“种子”代表了干细胞,“土壤”代表了组织微环境,“种子”的耗竭与“土壤”的恶化是组织器官衰老的核心。基于衰老组织的这些特征性变化,我们提出了“除草、施肥、播种”的抗衰老综合策略:清除衰老细胞、改善组织微环境、补充干细胞,并依据这一策略,对现有的抗衰老技术进行新的归类。

bFGF对hBMSCs增殖及成软骨能力影响的实验研究

目的探索碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)增殖和成软骨能力的影响,并确定适用于hBMSCs体外软骨构建的细胞代次。方法获取hBMSCs,分别用DMEM和DMEM+bFGF培养基进行培养。两组细胞均传代至第4代,比较两组各代次hBMSCs的形态变化、细胞得率;取第3代细胞,用pellet法体外成软骨诱导培养3周,观察两组pellet大体观并进行Ⅱ型胶原染色。在上述实验基础上,取hBMSCs用DMEM+bFGF培养基进行培养,1∶3传代培养至第8代,观察各代次细胞的形态变化;对各代次pellet体外成软骨诱导培养3周后,行大体观察并进行Ⅱ型胶原染色。结果 DMEM+bFGF培养体系下的细胞形态、细胞得率及成软骨能力等方面均优于DMEM组。DMEM+bFGF培养体系下,按照1∶3传代的细胞传至第6代仍能维持较好的细胞形态;第1~4代细胞均表达软骨特异性细胞外基质Ⅱ型胶原,第5及后续代次的细胞成软骨能力较差。结论 bFGF可明显促进hBMSCs增殖,并可更好地维持hBMSCs的成软骨能力,在该培养体系下的第1~4代细胞适用于体外软骨构建。

柠檬酸酸蚀后再植牙根表面的脱矿研究

目的研究不同脱矿方法酸蚀牙根后,根面形貌的变化及胶原纤维暴露面积,探索牙根再植的最佳存活条件。方法收集离体狗牙,制备5 mm×5 mm大小的根片,随机分为7组:A组未经酸蚀处理,即空白对照组;B组采用30%柠檬酸浸泡处理1 h;其余5组使用浸有30%柠檬酸溶液的小棉球擦拭牙面,时间分别为3 min、5 min、10 min、20 min和30 min,设为C-3、C-5、C-10、C-20、C-30组。处理后样本扫描电镜观察根面微观形貌。热重分析仪SDT检测酸蚀处理对牙根无机物损耗的影响。在根面接种骨髓间充质细胞,观察细胞早期附着及增殖情况。结果未处理的根面可见明显玷污层,经柠檬酸浸泡1 h后根表面光滑,未见有暴露的胶原纤维。而使用擦拭方法处理的根面不仅能去除玷污层,而且能暴露胶原纤维,且随擦拭时间的变化暴露的胶原量也有明显差异。C-5组根面暴露的胶原面积高于C-3组,而处理时间超过10 min的根面可以发现牙骨质的大面积脱矿,牙本质小管暴露,且胶原纤维也随着牙骨质的剥脱而破坏。此外,接种在酸蚀根面的细胞附着形态较好,增殖活性强于未处理根面。结论柠檬酸根面擦拭处理5 min为理想的再植牙根表面处理方式。

JNK抑制剂对软骨细胞外基质合成的作用研究

目的探索JNK抑制剂(SP600125)对软骨细胞外基质合成的影响。方法获取、培养兔耳软骨细胞,通过CCK-8法测定SP600125对细胞增殖的影响。将兔耳软骨细胞接种于PGA/PLA支架,构建细胞-支架复合物,并随机分为实验组与对照组。实验组将细胞-支架复合物置于含有10%FBS和SP600125的DMEM中培养,对照组在含有10%FBS的DMEM中培养。体外培养8周后,RT-PCR检测IGF、COLⅡ、COLⅨ、TGF-β1等软骨特异性基因的表达,并行HE染色与Safranin-O染色。结果 CCK-8法检测显示,相较对照组,实验组软骨细胞的增殖明显增强;体外培养8周后,实验组软骨特异性基因IGF、COLⅡ、COLⅨ、TGFβ1的表达显著下降(P<0.05);组织学观察显示,实验组软骨陷窝的成熟度低,细胞外基质分泌减少。结论 SP600125可降低软骨细胞外基质的合成。

以PECAM-1为标志去除残留未分化胚胎干细胞的研究

目的 以血小板内皮细胞黏附分子-1（Platelet endothelial cell adhesion molecule-1,PECAM-1）为标志,去除小鼠胚胎干细胞（Embryonic stem cells,ESCs）中残留未分化的细胞,以去除其致瘤性,为ESCs在研究中的安全应用提供思路。方法 将小鼠R1胚胎干细胞株在撤去白血病抑制因子的培养基中悬浮培养6 d,体外自发分化形成类胚体,消化打散后,以PECAM-1为标志进行磁珠分选,得到阳性与阴性细胞群体,分别以2×10^6个/点注射入裸鼠背部皮下,6-8周后观察畸胎瘤形成情况,组织学分析瘤体构成。结果 裸鼠背部成瘤结果显示,PECAM-1^＋细胞群注射8个点中7个成瘤,成瘤率87.5%;而PECAM-1^-细胞群注射8个点中1个成瘤,成瘤率12.5%。PECAM-1^＋细胞群与PECAM-1^-细胞群成瘤率具有统计学差异（P=0.01）。结论 应用PECAM-1可去除体外分化过程中的残留未分化ESCs,并去除其致瘤性。

高代次人皮肤成纤维细胞的热原检测及致敏性研究

目的对多个样本的高代次(第2～10代)人皮肤成纤维细胞进行热原检测及致敏性研究,为其作为组织工程肌腱种子细胞的安全性提供相关依据。方法采用胶原酶消化法获取人皮肤成纤维细胞,在体外扩增培养、传代至第10代并收集培养细胞的上清液作为实验组,同时收集第2代细胞培养上清液作为对照,根据《医疗器械生物学评价》等国家规定的相关标准实验方法,分别对所收集的不同样本上清液进行热原检查和致敏性分析。结果各样本实验组和对照组动物均未发生明显的体温异常变化和皮肤过敏反应,根据国家相应标准判断为阴性结果。结论高代次(第10代以内)人皮肤成纤维细胞无热原,且不会产生致敏反应,用于组织工程肌腱构建具有较高的安全性。

高压静电场技术制作藻酸钙载药微球及其性能研究

目的探索高压静电场技术制备藻酸钙微球的最佳参数组合,以期微球直径更小更均匀,并研究其载药后的缓释行为。方法设置不同的电压、CaCl2浓度、藻酸钠浓度、离心机转速、针头直径,观察微球直径和表面形态,以直径更小更均匀为标准,筛选最佳参数组合。负载低(L组)、中(M组)、高(H组)3种浓度的牛血清白蛋白,对比3组的包封率和载药率,并绘制累计缓释曲线,观察其体外缓释行为。结果16KV电压、1MCaCl2浓度、0.5%藻酸钠浓度、200r/min和30G的针头是最佳参数组合。L、M、H各组的包封率分别为(91±1.46)%、(85±1.63)%和(79±3.29)%,载药率分别为(0.89±0.04)%、(2.56±0.57)%和(4.10±1.21)%。3组药物都可以持续释放超过28d,缓释时间较长,释放行为稳定、规律。结论利用最佳参数组合制备的藻酸钙微球是一种优良的药物缓释载体。

模块化与血管化组织工程技术

大尺寸的复杂器官构建是组织工程构建技术未来的重大挑战。其中有2个核心问题,一个是如何在可操作的厘米级尺寸器官内建立可吻合的血管循环,另一个是如何模拟天然组织中的细胞分布。模块化组织工程技术是基于"自下而上"理论兴起的构建理念,理论上利用该技术能从根本解决上述问题。随着干细胞与生物材料研究的深入,类器官和生物打印技术层出不穷,构建技术也需要随之发展,最终实现从人造组织整体植入的模式变化为带血管蒂吻合的"活体器官"移植。