碱性成纤维细胞生长因子基因转染对犬牙龈成纤维细胞的影响

背景：研究发现，局部应用外源性碱性成纤维细胞生长因子可明显促进体外培养牙龈成纤维绌胞的增殖，口内局部应用可加速牙龈组织伤口的愈合。目的：观察碱性成纤维细胞生长因子基因转染对Beagle犬牙龈成纤维细胞生物学特性的影响。设计、时间、地点：观察对比体外细胞学实验，于2008-04／09在福建医科大学细胞与发育工程中心及解放军南京军区福州总医院比较医学科完成。材料：Beagle犬4只，12月龄，体质量10-13kg，雄性；含有人全长碱性成纤维细胞生长因子cDNA的plRES2．EGFP．bFGF质粒为自行构建。方法：切取Beagle犬左上颌第2，3，4前磨牙的游离龈，无菌磷酸盐缓冲液冲洗4遍，将组织块剪碎后用2．5g／L的胰酶37℃消化2h，离心后弃上清，加入含体积分数为10％胎牛血清的DMEM，接种于6孔板并覆盖玻片，置丁37℃、体积分数为5％C02的培养箱培养，取对数生长期细胞消化传代。利用脂质体介导法将plRES2．EGFP．bFGF质粒转染Beagle犬牙龈成纤维细胞，以空质粒转染组及未转染组作为对照。主要观察指标：MTT法检测牙龈成纤维细胞增殖状况；AO／EB双染色检测牙龈成纤维细胞凋亡：化学比色法检测牙龈成纤维细胞碱性磷酸酶活性。结果：3组细胞均在转染后第3天开始进入对数生长期。MTT检测结果显示，转染后随着时间改变，与空质粒转染组及未转染组相比，实验组牙龈成纤维细胞的增殖能力明显增强（P〈0．05），而空质粒转染组及未转染组差异无显著性意义（P〉0．05）。AO／EB双染色结果显示，实验组牙龈成纤维细胞凋亡率低于空质粒转染组及未转染组（P〈0．05）。转染碱性成纤维细胞生长因子基因后，牙龈成纤维细胞碱性磷酸酶活性未见明显改变，与未转染细胞差异无显著性意义。结论：碱性成纤维细胞生长因子基因转染可以加速牙龈成纤维细胞的增殖，抑制其凋亡，无促使牙龈成纤维细胞骨向分化的作用。

人碱性成纤维细胞生长因子真核表达质粒的构建及其在犬牙龈成纤维细胞中的表达

目的:构建pIRES2-EGFP-bFGF真核表达质粒并检测其在Beagle犬牙龈成纤维细胞(GFs)中的表达。方法:双酶切获得bFGF片段并克隆到真核表达载体pIRES2-EGFP中,HindⅢ单酶切、序列分析鉴定获得的质粒;脂质体介导转染Beagle犬GFs;免疫组织化学,RT-PCR,ELISA检测bFGF基因的表达。结果:bFGF成功插入真核表达载体pIRES2-EGFP中,转染GFs 12 h后即可观察到转染的GFs表达绿色荧光蛋白,48 h后转染效率达到20%。免疫组织化学,RT-PCR,ELISA证实重组pIRES2-EGFP-bFGF在GFs中的表达。结论:成功构建真核表达质粒pIRES2-EGFP-bFGF,并可在GFs中表达。

Pin1抑制剂对小鼠植入前胚体外发育的影响

目的观察Pin1在小鼠植入前胚中的定位分布及其抑制剂胡桃醌(Juglone)对小鼠植入前胚体外发育的影响。方法免疫荧光染色观察不同发育阶段植入前胚中Pin1的分布;收集小鼠1-细胞胚,以KSOM培养液为对照组,以培养液中添加有不同浓度的Juglone为实验组,观察各组1-细胞胚体外发育情况;Real-time PCR检测体外发育2-细胞胚内干细胞转录因子(Sox2、Oct4、c-Myc和Klf4)m RNA表达水平。结果小鼠不同发育阶段植入前胚中都存在Pin1的表达,胞质和胞核内均有分布,且核内荧光着色明显比胞质强;10μmol/L和25μmol/L胡桃醌持续作用93h(注射人绒毛膜促性腺激素后27h^120h)使1-细胞胚阻滞于2-细胞阶段,极少能过渡至4-细胞胚(P<0.01)。25μmol/L胡桃醌短时间作用18h(注射人绒毛膜促性腺激素后27~45h)同样使1-细胞胚发育阻滞于2-细胞胚(P<0.01);25μmol/L胡桃醌组2-细胞胚内Sox2 m RNA表达水平低于KSOM组(P<0.05),而Klf4、cMyc和Oct4 m RNA表达水平无明显变化(P>0.05)。结论小鼠1-细胞胚之后,Pin1主要定位在细胞核内,提示其可能参与细胞转录活动。且Pin1抑制剂(胡桃醌)能使2-细胞胚至4-细胞胚过渡率明显降低,并使干细胞转录因子Sox2 m RNA表达下调,提示Pin1在小鼠植入前胚早期发育阶段具有一定作用,其参与调控合子基因组激活与干细胞转录因子Sox2有关。

人骨形成蛋白-7真核表达质粒的构建及其在骨髓基质细胞的表达

目的利用基因工程原理构建pIRES2-EGFP-hBMP-7真核表达质粒并检测其在Beagle犬骨髓基质细胞(BMSC)的表达。方法利用DNA重组技术,将hBMP-7片段克隆到真核表达载体pIRES2-EGFP中,EcoRⅠ单酶切、PCR及序列分析鉴定获得的重组质粒;脂质体介导的方法转染Beagle犬BMSC;免疫组织化学染色检测hBMP-7基因的表达。结果hBMP-7被定向插入到真核表达载体pIRES2-EGFP中,转染BMSC 24 h后可观察到转染的BMSC表达绿色荧光蛋白,48 h后转染效率达到31%。免疫组织化学染色证实重组pIRES2-EGFP-hBMP-7在BMSC中的表达。结论利用基因工程原理成功构建真核表达质粒pIRES2-EGFP-hBMP-7,并可在BMSC中表达。

人精子甘露糖受体参与诱导卵母细胞皮质颗粒反应

目的研究人精子甘露糖受体与卵母细胞皮质颗粒反应的关系。方法以亲和层析法纯化的人精子甘露糖受体(purified mannose receptor,pMR)作用去透明带金黄地鼠卵,继而用罗丹明偶联的兵豆凝集素(Tetramethylrhodam ine Isothiocyanate Labeled Lentil,TRITC-LCA)标记。通过荧光显微镜观察被标记的皮质颗粒及卵母细胞表面甘露糖基的变化情况。结果pMR作用卵母细胞后,卵母细胞内的皮质颗粒减少且细胞表面的甘露糖基数量增加。结论pMR作用于卵母细胞表面后,可触发皮质颗粒反应,并使皮质颗粒部分内容物转移到卵母细胞表面。

阻滞和非阻滞品系小鼠次级卵母细胞基因表达水平的比较

目的：通过基因芯片检测阻滞品系昆明（KM）小鼠和非阻滞品系B6C3F1小鼠次级卵母细胞（MⅡ卵）基因表达差异,探讨KM小鼠植入前胚体外发育阻滞是否与母源基因表达差异相关.方法：分别收集KM小鼠和B6C3F1小鼠MⅡ卵,运用基因芯片分析和real-time PCR验证,母源基因的差异表达.结果：基因芯片检测共筛出差异表达基因995个,其中B6C3F1小鼠MⅡ卵上调基因有793个;下调基因有202个.B6C3F1小鼠MⅡ卵表达上调的基因主要与调节基因转录、蛋白质合成与转运、氧化还原、生长因子等相关.结论：KM与B6C3F1小鼠植入前胚体外发育潜能不同可能与母源基因表达差异相关.

传代培养对供核细胞胰岛素样生长因子Ⅱ基因表达的影响

目的通过建立一种简便可靠的胰岛素样生长因子Ⅱ(IGF2)基因实时荧光定量PCR检测方法来探讨传代培养对供核细胞中IGF2基因表达的影响。方法通过实时荧光PCR,选择合适的"相对标准品"绘制相对标准曲线,检测来源于鼠耳的成纤维样细胞IGF2的表达。结果通过实时PCR的相对定量检测出在鼠耳成纤维样细胞的传代培养中,随着培养代数的增加,IGF2的表达减弱。结论双标准曲线的实时荧光PCR相对定量法用于检测IGF2的表达是可行的;培养代数影响IGF2基因的表达,为体细胞克隆研究中供核细胞的选择及后续的基因印迹研究奠定基础。

实时荧光定量PCR检测传代培养细胞Grb10的表达

目的建立一种可靠的Grb10印迹基因实时荧光定量PCR方法,检测传代培养鼠尾成纤维样细胞中Grb10表达的差异。方法通过实时荧光PCR,选择合适的"相对标准品"绘制相对标准曲线,检测传代培养细胞中印迹基因Grb10的表达水平。结果相对标准曲线有较好的线性(r=0.999及0.984);实时荧光定量PCR方法检测出随着细胞培养代数的增加印迹基因Grb10表达水平上升。结论双标准曲线的实时荧光定量PCR法用于检测Grb10的表达准确可靠;传代培养可能影响鼠尾成纤维样细胞中印迹基因Grb10的表达水平。

人精子甘露糖受体表达的细胞生理状态

目的 探讨人精子甘露糖受体 (MR)的表达与精子所处生理状态的关系。 方法 对人精子进行体外获能和诱导顶体反应处理 ,以 FITC- DMA为探针检测获能前后和诱导顶体反应精子的 MR表达率 ,以 CTC染色监控精子的生理状态 ;对 MR表达的分类百分率与 CTC染色的精子分类百分率作线性回归分析。 结果 MR- 、 型表达率变化均与 CTC监控的精子顶体反应率变化高度正相关 ,MR- 型与获能负相关。 结论 MR的表达反映了精子的顶体反应状况而非获能状况 。

5-氮脱氧胞苷及曲古抑菌素A影响供核细胞H19基因表达的时间依赖性及浓度依赖性

目的:探讨甲基转移酶抑制剂——5-氮脱氧胞苷(5-aza-2′-deoxycytidine,5-aza-dC)和组蛋白去乙酰基酶抑制剂——曲古抑菌素A(trichostatin A,TSA)影响供核细胞H19基因表达的时间依赖性和浓度依赖性。方法:用不同浓度5-aza-dC及TSA按不同作用时间处理供核细胞(鼠尾尖成纤维样细胞),利用实时定量PCR法检测处理后H19基因的表达。结果:不同浓度的5-aza-dC处理组之间H19的表达无明显差异,但延长作用时间可使H19表达增强;TSA使H19的表达下降,但无时间依赖性。结论:长时间低浓度的5-aza-dC能增强供核细胞中H19基因的表达,而TSA则使H19的表达减弱,为体细胞克隆中表观遗传修饰抑制剂的选择及后续基因印迹研究提供了依据。

人精子甘露糖受体对地鼠卵母细胞超微结构的影响

目的研究人精子甘露糖受体(MR)在精卵融合中的作用。方法去透明带金黄地鼠卵经不同浓度的纯化人精子MR作用后,用透射电子显微镜观察卵母细胞超微结构的变化。结果MR作用卵母细胞后,卵母细胞内的皮质颗粒(CG)减少,并伴随有CG胞吐现象,同时卵母细胞表面的微绒毛数量减少。结论MR作用于卵母细胞表面后,可触发CG胞吐,并促使卵母细胞表面微绒毛减少,提示MR在介导精子与卵母细胞识别与融合中起作用。

Igf2r及Mest印迹基因在供核细胞中的表达及意义

目的:探讨细胞传代培养对胰岛素样生长因子Ⅱ受体(insulin-like growth factor Ⅱ receptor,Igf2r)和Mest基因表达的影响,以及它们在不同部位来源的成纤维样细胞(fibroblast-like cells)中的表达。方法:利用实时定量PCR法检测印迹基因Igf2r和Mest在来源于鼠耳和尾尖的成纤维样细胞中的表达。结果:在鼠尾成纤维样细胞的传代培养中,随着培养代数的增加,Igf2r的表达减弱,Mest的表达无明显变化;Igf2r在鼠尾成纤维样细胞中的表达高于鼠耳。结论:传代培养影响Igf2r基因的表达,Igf2r在不同部位来源的成纤维样细胞中的表达具有差异,为供核细胞的选择及后续的基因印迹研究奠定了基础。

小鼠早期胚发育全程微分干涉差显微观察

目的对小鼠早期胚发育全程进行系统的微分干涉差显微观察并制成图谱。方法通过体外受精和体内受精方法获得小鼠卵母细胞和早期胚胎,利用倒置微分干涉差显微镜观察排卵前卵母细胞至扩展囊胚的早期胚发育全过程,数码显微摄影系统拍照。结果记录排卵前卵母细胞至扩展囊胚的小鼠早期胚发育全过程,制成微分干涉差显微图谱。结论微分干涉差显微镜观察卵母细胞和各阶段早期胚,立体感强,对比度适当,可以准确生动地显示微细结构,所形成的图谱可供胚胎培养与操作借鉴。

受精前后地鼠卵母细胞皮质颗粒的变化

为观察人精子与地鼠卵异体受精前后,卵母细胞内皮质颗粒的变化,采用罗丹明偶联的兵豆凝集素标记受精前、受精30min和3h后金黄地鼠的去透明带卵母细胞,用激光共聚焦显微镜观察皮质颗粒的分布情况,结果显示,受精前卵母细胞内的皮质颗粒散在于卵质膜下和皮质区,受精后皮质颗粒数量减少,并发生边集。说明人精子与金黄地鼠卵异体受精时,可引起皮质颗粒向卵质膜靠拢并胞吐。

成年大脑神经细胞特异性ADAM10基因敲除小鼠模型的建立与鉴定

去整合素和金属蛋白酶10(ADAM10)是一种能够水解30余种跨膜蛋白质的"脱落酶"(sheddase),参与诸多生理过程和致病机制,如胚胎发育、细胞粘附、信号转导、免疫反应、癌症和阿尔茨海默病。迄今,已报道的ADAMIO完全基因敲除小鼠和大脑神经前体细胞特异性ADAM10基因敲除小鼠分别于胚胎期或围产期死亡,致使无法研究成年小鼠大脑神经细胞ADAM10基因的功能。文章利用本研究小组建立的CaMKlla-Cre转基因小鼠与ADAM10loxP/loxP转基因小鼠杂交,获得了CaMKIIα-Cre/ADAM10loxP/loxP小鼠,并对其进行鉴定。利用PCR方法检测成年ADAM10cKO小鼠大脑基因组DNA表明,ADAM10基因缺失主要发生在前脑皮层和海马中。荧光定量PCR检测结果显示,ADAM10 mRNA的表达水平在前脑皮层和海马中分别降低55.7%和60.8%;使用Western blotting方法研究发现,ADAM10成熟蛋白质的含量在前脑皮层和海马中分别减少63%和84.8%。采用免疫组织化学方法检测表明,成年ADAM10cKO小鼠与野生型小鼠相比,其大脑皮层和海马神经细胞的ADAM10免疫染色明显减弱,而其它细胞如胶质细胞的免疫染色基本一致。总之,文章成功制备了首个存活至成年的大脑神经细胞特异性ADAM10基因敲除(cKO)小鼠,克服了小鼠因ADAM10缺失在胚胎期或围产期死亡的弊端,为研究成年小鼠大脑神经细胞ADAMIO基因的功能奠定了坚实的基础。

精卵融合机制研究进展

精卵融合是发生在有性生殖过程中最重要的事件之一,其分子机制至今还未完全阐明。基因打靶已经被证明是一个能够揭示细胞间相互作用候选分子功能的权威工具,以前通过抗体抑制试验认为介导了精卵融合的关键性分子因为基因功能的深入研究而被一一否定,如整合素、ADAM1、ADAM2、ADAM3。近年来作为参与精卵融合的候选分子,如CD9、Izumo、甘露糖受体等,已经引起广大研究者的关注。

分离方法对移植卵巢卵泡发育的影响

目的评估机械法、酶解法和酶解-机械结合法等分离方法对小鼠移植卵巢分离卵泡的发育及其生殖潜能的影响,建立更好的卵泡分离技术方案。方法B6D2F1新生小鼠卵巢移植后分别用机械法、长时酶解法、短时酶解法或酶解-机械结合法分离卵巢组织中的腔前卵泡,分离回收卵泡在体外培养12d时加入绒毛膜促性腺激素(hCG)处理26h,收获卵丘复合体进行体外受精。结果机械法的卵泡回收量、卵泡培养残存率、排卵率均高于酶解法,短时酶解法的排卵率高于长时酶解法;酶解-机械结合法的平均卵泡回收量、平均排卵数、卵母细胞成熟率等多项指标均高于其他各组。结论酶解-机械结合法是分离小鼠卵泡良好的技术方案。

表观遗传修饰剂对重构胚发育的影响

自从“Dolly”绵羊克隆成功后，先后有哺乳动物鼠、猪、牛、狗、马等克隆成功的报道，但目前哺乳动物体细胞核移植成功率仍很低，其主要与卵母细胞对供体核的不完全重编程有关。核重编程主要表现为供体核基因的表观遗传改变并指导重构胚胎的正常发育。在核移植过程中，体细胞（供核细胞）携带着其组织所特有的表观遗传修饰标志，这种标志在核重编程中必须被清除。

小鼠窦前卵泡的玻璃化冷冻方法研究

目的对性成熟前小鼠的窦前卵泡采用不同的方法进行玻璃化冷冻,探讨不同冷冻方法对卵泡复苏率的影响。方法用Ⅰ型胶原酶和脱氧核糖核酸酶Ⅰ分离10～14dICR雌鼠的卵巢,共进行A、B两个实验,每次实验对获得的卵泡分为4组,1组作为新鲜对照组,其余3组采用不同的冷冻方法处理,试验A采用常规玻璃化法、-205℃玻璃化法和液氮网篮法;试验B采用-205℃玻璃化法、液氮网篮法和-205℃表面玻璃化法,卵泡复苏后进行台盼蓝染色,计算各组卵泡复苏率。结果液氮网篮和-205℃玻璃化冷冻的冷冻效果一致,两种方法的卵泡复苏率差别无统计学意义;常规玻璃化的冷冻效果最差,-205℃表面玻璃化冷冻的冷冻效果最好,其冷冻小鼠窦前卵泡的复苏率达(83.02±4.10)%。结论-205℃表面玻璃化是一种较好的冷冻窦前卵泡的方法。

人精子甘露糖受体的表达与精卵融合的关系

目的:研究人精子甘露糖受体(MR)的表达与精卵融合的关系。方法:正常人活精子获能培养后与去透明带金黄地鼠卵行精子穿透试验(SPA)监测精卵相互作用,同时用异硫氰酸荧光素偶联的甘露糖化牛血清白蛋白(FITC-DMA)检测精子甘露糖受体的表达并分析SPA各项指标与精子甘露糖受体表达的关系。结果:SPA指标中穿透指数、结合指数均与精子MR表达率呈正相关。结论:人精子MR与精-卵膜融合密切相关,可能起某种介导作用。