人二倍体细胞株HLF-02的建立及其生物学特性

目的 :建立HLF 0 2细胞株 ,为老年学 ,肿瘤学 ,病毒学 ,药物学和生物遗传学等研究提供新的实验材料。方法 :人二倍体细胞株HLF 0 2取于肺组织 ,用胰蛋白酶消化肺组织 ,可获 90 %以上具有正常代谢活性的肺细胞 ,对存活的肺成纤维细胞进行形态学观察、生长特性检查、核型分析、电镜观察和异种移植等。结果 :建成的HLF 0 2细胞株其形态表现、电镜观察、核型分析和异种移植等均符合二倍体细胞特征。经过 10个月的体外培养 ,共传 5 0代 ,细胞倍增时间 75 .5h ,染色体始终保持二倍体特性 ,异种移植成瘤试验阴性 ,无支原体污染。结论 :HLF 0 2是一株人二倍体细胞株 ,可用于对细胞老年学 ,肿瘤学 ,病毒学 ,药物学和生物遗传学等方面的研究。

黄芪-壳聚糖/聚乳酸多孔支架对犬骨髓基质细胞生物学行为的影响

目的:观察黄芪壳聚糖/聚乳酸、壳聚糖/聚乳酸多孔支架复合材料对犬骨髓基质细胞(BMSCs)的黏附、生长及分化的影响,寻找较合适的牙周骨组织工程复合物支架材料。方法:将诱导分化的犬BMSCs分别与黄芪壳聚糖/聚乳酸、壳聚糖/聚乳酸支架体外培养。第5天取材,测定2种材料的吸附率,用扫描电镜观察超微结构,以免疫组织化学检测I型胶原,放射免疫法检测骨钙素的分泌情况。结果:BMSCs与2组材料均能形成良好贴附,黄芪壳聚糖/聚乳酸复合材料上贴附的细胞吸附率、Ⅰ型胶原及骨钙素的分泌量高于壳聚糖/聚乳酸组。结论:黄芪壳聚糖/聚乳酸能促进BMSCs生长、分化及基质分泌,是一应用前景良好的组织工程骨构建复合材料。

筋脉通含药血清对高糖培养的Schwann细胞诱导型一氧化氮合酶和NADPH氧化酶p22-phox亚基表达的影响

目的:探讨筋脉通含药血清对高糖培养的Schwann细胞诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,i NOS)蛋白表达及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotidephosphate,NADPH)氧化酶p22-phox亚基mRNA表达的影响。方法:雄性Wistar大鼠随机分为3组,分别灌胃筋脉通、维生素C或蒸馏水制备含药血清和对照血清。取新出生大鼠的双侧坐骨神经用于制备Schwann细胞。将体外培养的Schwann细胞分为高糖组、筋脉通组(加入筋脉通含药血清)、维生素C组(加入维生素C含药血清)及正常对照组。培养48h后,采用免疫荧光法检测Schwann细胞内i NOS蛋白的表达,实时荧光定量聚合酶链式反应法检测NADPH氧化酶p22-phox亚基mRNA的表达。结果:高糖培养的Schwann细胞内i NOS蛋白表达及NADPH氧化酶p22-phox亚基mRNA表达均较正常对照组明显升高(P<0.01);与高糖组比较,筋脉通组i NOS蛋白表达及NADPH氧化酶p22-phox亚基mRNA表达明显降低(P<0.01),且明显优于维生素C组(P<0.01)。结论:筋脉通含药血清可以下调高糖培养的Schwann细胞i NOS蛋白及NADPH氧化酶p22-phox亚基mRNA的表达。

应用聚合酶链式反应鉴定实验细胞的来源种属

目的应用聚合酶链式反应(PCR)鉴定常见细胞的种属来源,以判断培养细胞是否存在种间的交叉污染。方法根据文献报道和NCBI数据库我们得到了32对种属特异性引物,并分别针对10种常见的细胞种属,对这些引物进行特异性和敏感性的筛选;以待检测细胞的基因组DNA为模板进行PCR及后续的琼脂糖凝胶电泳;以不同种属来源细胞的DNA混合物作为阳性对照模板,以水作为阴性对照模板。结果针对上述10种常见细胞来源的种属分别得到了1对特异性和敏感性均较好的引物,经PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳后可以准确鉴定待检测细胞的种属来源,并判断该细胞是否存在种间污染。结论应用聚合酶链式反应可以简便、快速地鉴定实验细胞的种属,并判断该细胞是否存在种间的交叉污染。

筋脉通含药血清降低高糖培养大鼠雪旺细胞活性氧水平及PARP-1蛋白表达

目的研究筋脉通含药血清对体外高糖培养雪旺细胞活性氧(ROS)水平及多聚(ADP-核糖)聚合酶-1(PARP-1)蛋白表达的影响。方法 30只雄性SD大鼠随机分为3组,分别灌胃筋脉通(JMT)、维生素C(VC)或蒸馏水制备含药血清和对照血清。取新出生大鼠的双侧坐骨神经用于制备雪旺细胞,分为高糖组、JMT组(加入筋脉通含药血清)、VC组(加入维生素C含药血清)及正常对照组。培养48 h后,采用激光扫描共聚焦显微技术检测细胞内二氯荧光黄(DCF)的荧光强度而测得细胞内ROS水平;采用免疫印迹法(Western blot)检测细胞PARP-1(89 ku)的蛋白表达。结果 1)高糖组雪旺细胞ROS-DCF荧光值(86.59±8.14)显著高于正常值(P<0.01);筋脉通含药血清组(44.58±8.67)与维生素C含药血清组(46.12±8.80)均显著低于高糖组(P<0.01)。2)与正常组比较,高糖组雪旺细胞内PARP-1(89 ku)含量(0.712±0.012)明显增加(P<0.01);与高糖组比较,筋脉通含药血清组含量(0.307±0.025)明显降低(P<0.01),且明显优于维生素C组(0.594±0.017)(P<0.01)。结论筋脉通含药血清能显著减少ROS生成,降低PARP-1的活性和酶解,减轻细胞DNA氧化损伤。

丝裂霉素诱导人肝癌细胞凋亡

目的建立化疗药物体外诱导肝癌细胞凋亡的模型,为进一步研究化疗诱导肝癌细胞凋亡的分子机制奠定基础。方法丝裂霉素(MMC)处理人肝癌细胞系HepG2,荧光显微镜和透射电镜观察肝癌细胞的形态学改变,琼脂糖凝胶电泳检测凋亡细胞DNA片段的“梯状”条带,流式细胞仪分析以进一步了解凋亡发生的程度及细胞周期分布情况。结果 MMC能以时间和浓度依赖方式诱导肝癌细胞凋亡,8g·L^(-1)作用24h后肝癌细胞出现凋亡,至48h达高峰。形态学上可见细胞浓缩,核固缩,染色质浓聚聚边等典型凋亡特征;琼脂糖凝胶电泳观察到独特的DNA“梯带”。流式细胞仪检查发现典型的凋亡峰。4g·L^(-1),8g·L^(-1)和16g·L^(-1)药物处理组的细胞凋亡百分率分别为15.83±5.72,20.33±5.73及17.00±6.41,与对照组(1.90±0.48)比较,均有显著性差异(P<0.01);而且8g·L^(-1)组与其他两组比较差别亦有显著性(P<0.05)。空白对照组中,分布在G_1,S,G_2/M各期的细胞比例分别为0.79,0.12,0.09,而经药物处理后相应细胞周期分布为0.53,0.39和0.08,提示肝癌细胞生长明显受阻于G_2/M期。结论 MMC能以时间和浓度依赖方式诱导肝癌细胞凋亡,该凋亡模型的建立将有助于进一步探讨化疗药物诱导肝癌细胞凋亡的分子机制和化疗药物作用机制。

高浓度葡萄糖通过下调自噬增加体外培养雪旺细胞的凋亡

目的观察高浓度葡萄糖对雪旺细胞自噬活性的影响以及自噬对高糖条件下雪旺细胞增殖活性及凋亡的影响。方法体外培养RSC96细胞,Western blot和免疫荧光法检测beclin1和caspase-3蛋白表达,MTT检测细胞增殖活性。结果高浓度葡萄糖组RSC96细胞beclin1的表达减少(P<0.05),细胞增殖活性降低(P<0.05,P<0.01)。自噬被抑制后加剧了高糖对细胞增殖活性的削弱作用(P<0.01),同时增加了高糖促进caspase-3的活化作用(P<0.01)。结论高浓度葡萄糖通过下调自噬活性增加细胞凋亡。

槲皮素通过自噬途径减轻高糖致体外培养RSC96细胞的损伤

目的观察槲皮素对高浓度葡萄糖培养的大鼠雪旺细胞系细胞(rat Schwann cell line,RSC96)自噬、增殖活性和凋亡的影响。方法高浓度葡萄糖(125 mmol/L)及槲皮素(25μmol/L)离体培养RSC96细胞,作用72小时后,噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法检测细胞增殖活性,原位末端标记法[terminal dexynucleotidyl transferase(Td T)-mediated d UTP nick end labeling,TUNEL]评价凋亡,Western blot法检测caspase-9活化的P35亚基、caspase-3活化的P20亚基及自噬相关蛋白Beclin1的蛋白表达。结果高糖抑制离体培养的RSC96细胞的增殖活性,吸光度(optical density,OD)值降低,凋亡率增加,P35亚基、P20亚基蛋白表达上调(P<0.05,P<0.01);槲皮素能够增加高糖培养RSC96细胞的增殖活性,下调P35、P20蛋白表达及凋亡率(P<0.05,P<0.01)。然而当自噬被抑制后,槲皮素上述保护作用则被削弱,细胞死亡增多(P<0.01)。结论槲皮素通过增加自噬以促进RSC96细胞的增殖、减少凋亡,从而减轻高浓葡萄糖的损伤。

氧化应激对猪眼小梁细胞内皮细胞白细胞黏附分子-1表达的影响

目的研究氧化应激对猪眼小梁细胞内皮细胞白细胞黏附分子-1(ELAM-1)表达的影响,探讨氧化应激诱导的ELAM-1的表达与白细胞介素1α(IL-1α)的关系。方法原代培养的猪眼小梁细胞经过血清饥饿培养后,用不同浓度白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1rα)处理或直接用1mmol/L的H2O2刺激后,用免疫细胞化学法检测小梁细胞E-LAM-1的表达。结果H2O2处理的原代培养的猪眼小梁细胞中ELAM-1表达呈阳性,高浓度(180μg/ml和600μg/ml)拮抗剂IL-1rα预处理的猪眼小梁细胞ELAM-1表达呈阴性。结论氧化应激可诱导猪眼小梁细胞表达ELAM-1。在体外细胞培养体系,高浓度的IL-1rα可拮抗氧化应激对ELAM-1表达的作用。

槲皮素通过Akt-mTOR途径上调高糖培养RSC96细胞的自噬

目的探讨槲皮素对高糖离体培养的RSC96细胞自噬变化规律的影响。方法 RSC96细胞培养于含有槲皮素的高糖培养基中,超微结构应用透射电子显微镜观察,用免疫荧光法、Western blot法检测Beclin1、LC3Ⅱ、磷酸化的Akt及磷酸化的m TOR蛋白表达,用实时荧光定量PCR法检测Beclin1 mRNA和LC3B mRNA的转录。结果高糖造成RSC96细胞Beclin1和LC3Ⅱ的表达下调,增加Akt和m TOR的磷酸化水平(P<0.05,P<0.01),造成病理形态改变,减少自噬体数量。槲皮素能够上调Beclin1和LC3Ⅱ的表达,下调Akt和m TOR的磷酸化水平(P<0.05,P<0.01),修复病理损伤,增加自噬体数量。结论槲皮素通过下调Akt-m TOR途径磷酸化水平而增加高糖培养RSC96细胞的自噬。

筋脉通含药血清对高糖培养施万细胞8-羟基脱氧鸟苷和活化的caspase-3表达的影响

目的探讨筋脉通含药血清对高糖培养施万细胞8-羟基脱氧鸟苷(8-hydoxydeoxyguanosine,8-OHdG)水平及活化的半胱氨酸天冬氨酸酶3(cysteine aspartase-3,caspase-3,)(17kDa)蛋白及mRNA表达的影响。方法将体外培养的施万细胞分为高糖组、筋脉通组(加入筋脉通含药血清)、维生素C组(加入维生素C含药血清)及正常对照组,采用酶联免疫吸附法检测施万细胞上清液中8-OHdG的分泌量,免疫荧光法检测活化的caspase-3(17kDa)蛋白表达,实时荧光定量PCR法检测活化的caspase-3(17kDa)mRNA的表达。结果与正常对照组比较,高糖培养施万细胞上清液中8-OHdG的分泌量及细胞内活化的caspase-3(17kDa)蛋白和mRNA表达均明显升高(P<0.01);与高糖组比较,筋脉通组细胞上清液中8-OHdG的分泌量及细胞内活化的caspase-3(17kDa)蛋白和mRNA表达明显降低(P<0.01)。结论筋脉通含药血清可改善高糖导致的施万细胞DNA氧化损伤和细胞凋亡,提示筋脉通可能改善糖尿病神经病变之氧化损伤及细胞凋亡。

中性粒细胞碱性磷酸酶(NPA)染色对不明热早期诊断价值的研究

目的通过中性粒细胞碱性磷酸酶(NAP)染色,探讨各种不明热病人NPA活性和阳性指数用来诊断及鉴别诊断的价值,以备早期及时诊断和治疗。方法应用快速偶氮联法对1103例,50多种不同疾病人进行NPA活性的阳性指数检测,并分组配对与正常组进行参比检测,经统计学处理,算出相关性、敏感性的特异性。结果在贫血组中,其中再障(AA),AA-PNH综合征,酶的活性明显高于其他贫血和正常组,相互之间有显著差异,P<0.01;在骨髓增殖性疾病(MPD)组中,真性红细胞增多征(PV),骨髓纤维化(MF)酶的活性较其他增殖性疾病和正常组明显增高,P<0.01;白血病组,急淋(ALL),慢淋(CLL),毛白(HCL),浆白(PCL),酶的活性较其他白血病和正常组明显增高,P<0.01,而急非淋M1、M2、M4、全髓性白血病(PMS)酶的活性最低;肿瘤组中,骨髓瘤(MM)酶的活性增高最明显,其次是非霍奇金淋巴瘤(NHL),而恶性组织细胞病(MH)酶的活性极度减低或消失为零,相互之间有显著差异P<0.01;在自身免疫性血小板减少性紫癜(AITP),全血细胞减少、粒细胞减少、血小板减少和脾亢等疾病中,除了AITP较正常不同程度增高,但经统计学处理,无明显差异,P>0.05;在感染疾病中,各种球菌感染,以及所致的粒细胞型类白细胞反应,酶的活性最高,立克次体次之,而病毒感染酶的活性较其他杆菌、寄生虫及正常组显著减低,相互之间有显著差异,P<0.01;其他疾病,如胶原病酶的活性较正常组有不同程度减低,而糖尿病不同程度增高,但经统计学处理,无明显差异,P>0.05。结论NAP对不同疾病人早期诊断及鉴别诊断敏感性和特异性诊断指标。

干细胞研究的意义和存在的问题

本文以干细胞的定义、造血和神经干细胞的研究和应用为基础 ,就干细胞研究的意义和存在的问题进行评述。重点就干细胞的扩增和鉴定、干细胞的可塑性和多能干细胞、干细胞在组织修复和个体发育中的意义进行讨论。介绍当前研究动向 ,从分子生物学水平充分认识干细胞的本质 ,认识主导干细胞繁殖、定向和跨系分化的内在机制 ,以更有效地发挥干细胞的潜能 。

人骨髓成骨细胞体外培养

目的 研究人骨髓基质干细胞体外培养及其成骨特性 ,为骨组织工程学研究提供成骨种子细胞。 方法 以人髂骨区骨髓为材料进行体外人骨髓基质干细胞培养 ,传代后改用含地塞米松、β -甘油磷酸纳和维生素C的条件培养基进行培养 ,用倒置显微镜观察、碱性磷酸酶染色、四环素荧光标记等方法对所培养的细胞进行生物学特性研究。 结果 接种细胞 4d即可传代 ,在条件培养液中 2周形成多层结构 ,并出现黑色结节 ,ALP染色阳性 ,结节四环素荧光标记、钙染色阳性 ,Ι型胶原免疫组化染色呈黄褐色。 结论 采用本法在体外培养的人成骨细胞生长良好 ,并具有成骨细胞形态特征和生物学特性 ,可做为临床所需的成骨种子细胞来源 ,为骨组织工程学研究奠定了实验基础。

高糖对体外培养雪旺细胞影响的研究进展

雪旺细胞在糖尿病周围神经病变过程中起着重要的作用,近年来伴随组织细胞体外培养技术的日趋成熟,探讨体外高糖环境对雪旺细胞的影响逐渐成为研究新热点。本文就近年来高糖环境对体外培养雪旺细胞影响的相关研究作一综述。

宫颈癌细胞系HCE_(1)的建立及其生物学特性

从 5例手术切除宫颈癌标本中取材进行体外培养 ,并建成一个新的连续细胞系 ,命名为湖南宫颈癌上皮细胞系 1号 (HCE1)。该细胞已在体外生存 18个多月 ,传 80多代。其生物学特性显示 :①该细胞系接种至裸鼠后可致瘤 ,其移植瘤细胞形态与原实体瘤相似 ;②电镜下可观察到细胞表面有丰富的微绒毛及核糖体 ;③检测第 2 5代细胞生长曲线 ,其倍增时间为 45 8h ;④计数 6个平皿软琼脂集落形成率平均值为 14 8% ;⑤染色体核型分析为非整倍体 ,众数为

成人鼻腔嗅区黏膜细胞的分离培养与免疫学特点

目的探讨成人鼻腔嗅区黏膜细胞的分离培养方法及嗅鞘细胞(OECs)的免疫学特点。方法通过手术取成人嗅区黏膜7例,将其消化为单个细胞后采用差速贴壁法除去成纤维细胞。倒置显微镜下行形态学观察,并利用p75、S100、GFAP抗体对嗅鞘细胞进行免疫荧光化学染色,共焦显微镜下进行各种抗体阳性率的统计。结果共焦显微镜下可见嗅黏膜细胞中S100和p75阳性细胞多见,GFAP阳性细胞在嗅黏膜细胞中较少见。一般在同一细胞上可见S100和p75共同表达,而GFAP与S100、p75未见有共同表达现象;p75阳性细胞胞体大小和形态也大不相同。经统计S100和p75阳性细胞的平均百分率为(35.0±8.3)%。结论成功进行了成人鼻腔嗅区黏膜细胞的分离培养。

改良消化复合植块法培养新生大鼠雪旺细胞

目的探讨改良的单酶消化法与组织贴块法相结合的培养雪旺细胞（SCs）的方法,并与经典植块法和普通消化复合植块法进行比较。方法取新生3～5 d的SD大鼠双侧坐骨神经和臂丛神经,分别采用经典植块法、普通消化复合植块法、改良消化复合植块法培养SCs。培养7 d后进行细胞消化和传代,在显微镜下计数并计算细胞总量。用S-100免疫荧光染色法检测所获细胞的纯度。结果改良消化复合植块法培养的SCs生长增殖速度最快,可获取（1.85±0.13）×10^6个细胞;普通消化复合植块法次之,可获取（1.10±0.10）×10^6个细胞;经典植块法所获SCs的生长增殖速度最慢,可获取（0.77±0.03）×10^6个细胞,3种方法比较差异均有统计学意义（P〈0.01）。S-100免疫荧光染色结果显示,改良消化复合植块法细胞纯度为（95.73±1.51）%,普通消化复合植块法为（84.66±2.68）%,经典植块法为（74.50±4.23）%,3种方法比较差异均有统计学意义（P〈0.01）。结论改良消化复合植块法可以在短时间内获得大量高纯度的SCs,为研究周围神经修复再生奠定良好的基础。

大鼠心肌微血管内皮细胞的体外原代培养

目的体外原代培养大鼠心肌微血管内皮细胞(MMVECs),并观察其生长特性。方法采用酶蛋白消化法培养大鼠MMVECs,用差速贴壁法和亚细胞克隆法纯化细胞,用第Ⅷ因子相关抗原和CD31相关抗原鉴定细胞,倒置相差显微镜下观察细胞生长状态。结果成功培养出纯度很高的MMVECs,可用于MMVECs相关实验研究。结论此原代培养MMVECs的方案具有较好的可操作性和可重复性。

人脐血间充质干细胞培养鉴定和慢病毒载体介导胶质源性神经营养因子在脐血间充质干细胞中的表达

目的体外分离和培养人脐血间充质干细胞(UCB-MSCs),对其生物学特性进行鉴定。用含有胶质源性神经营养因子(GDNF)的慢病毒载体转染UCB-MSCs,初步评价基因转染后UCB-MSCs生物学功能变化,探讨GDNF在UCB-MSCs中的表达水平。方法采用密度梯度离心法从脐血中分离单核细胞,通过贴壁培养和控制消化时间得到形态较均一的长梭形细胞,流式细胞仪(FACS)检测其细胞表面标记,诱导其向脂肪方向分化,对UCB-MSCs的生物学特性进行鉴定。将GDNF基因克隆入慢病毒载体,包装出病毒上清,以不同拷贝数转染UCB-MSCs,通过检测细胞表面抗原,观察细胞形态学和增殖分化能力的差异,初步评价基因转染对细胞生物学功能的影响。采用酶联免疫吸附实验(ELISA)和实时定量多聚合酶链反应(real-time PCR)技术分别测定不同转染组GDNF的蛋白及mRNA表达水平。结果采用密度梯度离心法成功在体外分离和培养出UCB-MSCs,并诱导其向脂肪细胞分化。FACS检测结果显示,UCBMSCs中CD90、CD73及CD105蛋白表达阳性,CD14、CD34、CD45、CD19、HLA-DR、Stro-1及CD106蛋白表达阴性。ELISA和real-time PCR检测结果显示,用含GDNF基因的慢病毒载体转染UCB-MSCs后,其GDNF蛋白分泌量和mRNA表达水平与转染拷贝数有关,转染拷贝数越高,GDNF表达量越高。GDNF基因转染后UCB-MSCs的原有生物学功能无明显改变。结论成功在体外分离和培养出UCB-MSCs。用含有GDNF基因的慢病毒载体转染UCB-MSCs可通过转染拷贝数在一定水平上控制GDNF蛋白分泌量和mRNA表达水平,使其持续高表达GDNF。