乳腺癌细胞抗原和自身淋巴结树突状细胞对细胞因子诱导的杀伤细胞作用研究

目的：从乳腺癌患者淋巴结 中分离和定向诱导培养扩增 树突状细胞（ＤＣ），观察其经自身肿瘤细胞抗原冲击后对自身细胞因子诱导的杀伤细胞（ＣＩＫ） 杀伤活性的影响。方法：取手术切除肿瘤周围转移的淋巴结，提取单个核 细 胞，将贴壁生长的细胞用细胞因子基因重组粒巨集落生长因子（ｒｈＧＭ－ＣＳＦ）、基因重组白介 素４（ｒｈＩＬ－４）、基因重组α－肿瘤坏死因子（ｒｈＴＮＦ－α）联合诱导培养ＤＣ，然后用 自身肿瘤细胞抗原冲击ＤＣ并作用ＣＩＫ，最后检测ＣＩＫ杀伤３种靶细胞（自身乳腺癌细胞、Ｋ５６２和 ＳＧＣ－７９０１细胞）的活性。结果：乳腺癌患者转移淋巴结中的贴壁细胞，经 细胞因子联合诱导培养，ＤＣ含量可达１５．３％～３７．０％。经自身肿瘤抗原冲击的淋巴结ＤＣ活化的Ｃ ＩＫ，杀伤自身肿瘤细胞活性达７１．３％，单纯ＣＩＫ为３７．０％，两者比较差异有显著性（Ｐ＜０ ．０１）；而对Ｋ５６２和ＳＧＣ－７９０１细胞杀伤活性无明显差异。结论：肿瘤周围转 移淋巴结贴壁细胞在体外能定向诱导扩增出大量ＤＣ；ＤＣ经自身肿瘤抗原冲击后能明显提高ＣＩ Ｋ对自 身肿瘤细胞的杀伤活性。

穿心莲内酯对人PBMC/PBM表达IL-18相关细胞因子的影响

目的:研究穿心莲内酯对外周血单核细胞表达IL-18相关细胞因子的影响。方法:不同浓度穿心莲内酯处理LPS刺激的PBMC(Peripheral Blood Mononuclear Cells,外周血单个核细胞)和LPS+IFNγ-/IL-4激活的磁珠分选PBM(PeripheralBlood Monocytes,外周血单核细胞),利用real-time RT-PCR法检测IL-18、IL-18BP、IL-18Rα、IL-18Rβ基因转录水平,ELISA法检测PBM上清中的IL-18、IL-18BP和IL-1β、IL-1Rα。结果:穿心莲内酯呈剂量和时间依赖地调节PBMC IL-18和IL-18BP的表达。穿心莲内酯处理使LPS刺激的PBMC IL-18BP转录增加,IL-18BP/IL-18比值升高;使LPS+IFNγ-激活的PBM表达IL-18BP/IL-18比值从9.60倍升高至214倍;IL-4激活的PBM表达IL-1Rα/IL-1β比值从9 200降低至6 520。结论:穿心莲内酯可调节激活的外周血单核细胞IL-18相关基因转录和表达,抑制炎症时IL-18的高表达。

P53融合蛋白对肺癌细胞生长的影响

目的研究蛋白转导域(PTD)与人野生型P53(wtP53)融合表达的融合蛋白PTD-P53对肺癌细胞增殖的影响。方法用PTD-P53处理人肺癌细胞H1299和NIC-H157后,采用细胞增殖抑制实验(MTT法)分析处理后观察细胞的生长情况,流式细胞术(FCM)分析处理后观察细胞的周期变化。结果PTD-P53对肺癌细胞的生长有明显的抑制作用,处理后细胞周期出现阻滞现象。结论采用PTD-P53治疗肺癌将会是一种有效的途径。

人胎盘提取液促成纤维细胞生长的研究

目的:从人胎盘中提取一种促成纤维细胞生长的美容产品。方法:通过对健康的新鲜胎盘的粗选、匀浆、酶消化、离心、DE-52阴离子交换柱层析,获得提取物,MTT法检测各抽提成分及不同成分混合的生物学活性。结果:柱层析后可获得三个不同成分:P1、P2、P3,P3活性明显,经混合活性不明显的P2后活性明显增强。结论:建立了从胎盘中提取活性成分的方法,以混合成分的形式作为一种美容产品,不仅可增强效果,还充分利用了资源,提高了单位产量。

重组人野生型P53融合蛋白的克隆表达和对肿瘤细胞的作用

目的通过基因重组改善P53蛋白的功能，并研究它对肿瘤细胞的作用。方法构建人野生型P53(wtP53)融合蛋白的原核细胞表达载体PGEX-3X—PTD—P53，诱导表达和亲和层析纯化后，采用MTT法和流式细胞仪检测它对肿瘤细胞的增殖抑制作用和促细胞凋亡。结果成功构建P53融合蛋白的原核细胞表达载体PGEX-3X—PTD—P53，通过诱导表达和纯化获得重组人wtP53融合蛋白。MTT法和细胞流式分析证明该蛋白对几种癌细胞有明显的增殖抑制作用和促细胞凋亡。结论这种原核细胞表达的重组人wtP53融合蛋白保留了wtP53蛋白的生物学性状。

重组碱性成纤维细胞生长因子游离巯基的测定分析

建立了一种紫外-可见分光光度检测法,可以快速、简便、稳定地测定重组碱性成纤维细胞生长因子的游离巯基含量。将检测试剂、标准品及待测样品一起反应后,在412 nm波长处读取OD值,以标准品浓度为横坐标,以吸光值为纵坐标,绘制标准曲线,根据标准曲线计算待测样品中游离巯基含量;同时对该方法进行了方法学验证。结果表明：该方法专属性强,游离巯基含量测定范围为20-80μg/ml,线性相关系数在0.999以上,回收率范围为91.7%-107.4%;而且该法精密度较好,精密度的变异系数范围为5%-8%。测得的分子表面和总游离巯基含量与理论一致,可用于蛋白质游离巯基检测,以监测分子结构的正确性与均一性。

人肝细胞生长因子真核质粒的克隆及活性测定

目的构建肝细胞生长因子的真核表达载体,为进一步利用基因治疗肝损伤打下基础。方法利用DNA体外重组技术,从胎盘提取HGFcDNA克隆到pcDNA3.1载体上,经限制性内切酶、PCR及测序鉴定重组体。转染HepG2和L02细胞并建立稳定细胞株,MTT法测其活性,并通过流式细胞技术检测细胞凋亡。结果pcDNA3.1-HGF重组体测序结果与GeneBank对照完全相同,MTT比色结果,转染HGF基因的HepG2细胞增殖速度明显低于未转染HGF基因的HepG2细胞（P〈0.05）,而转染HGF基因的L02细胞增殖速度明显高于未转染HGF基因的L02细胞（P〈0.05）,细胞流式技术检测结果也与之相符。结论成功构建了pcDNA3.1-HGF真核表达载体,pcDNA3.1-HGF对HepG2细胞有抑制作用而对L02细胞的生长有促进作用。

重组人野生型P53融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达与纯化

目的研究wtP53蛋白对肿瘤的治疗效果，提供药用wtP53融合蛋白。方法在本室构建的人野生型P53融合蛋白的原核细胞表达载体PGEX-3X-P53的基础上，IPTG诱导大肠杆菌表达wtP53融合蛋白，通过亲和层析柱纯化和因子Xa处理，SDS-PAGE分离。结果通过IPTG诱导后，在大肠杆菌中获得人野生型P53融合蛋白的高效表达，经过亲和层析纯化和Western印迹实验，表明获得重组人野生型P53融合蛋白。结论原核细胞表达的人wtP53融合蛋白具有天然P53蛋白的抗原性，可用于P53蛋白的体内外活性鉴定，以进一步应用于临床。

CHO细胞表达重组人生长激素-Fc融合蛋白糖基化类型的优化

目的优化CHO细胞表达重组人生长激素-Fc(recombinant human growth hormone-Fc,rhGH-Fc)融合蛋白,以获得更优的糖基化比例及更低含量的高甘露糖。方法在7 L生物反应器中培养表达rhGH-Fc的CHO细胞,通过改善补料培养基成分(使用3种商业化培养基:Gly-1:EX-CELL Glycosylation Adjust、Gly-2:SHEFF-CHO PLUS PG ACF、Gly-3:EfficientFeed C+AGT Supplement&GlycanTune C+Total Feed),对rhGH-Fc糖基化修饰进行调整,并通过质谱分析目的蛋白的糖基化类型及比例。结果Gly-1、Gly-2、Gly-3的G0F(主要糖型一般为G0、G1和G2,F为岩藻糖)分别为32.89%、58.66%、33.28%,G1F分别为31.39%、18.03%、34.90%,G2F分别为31.39%、18.03%、34.90%,Gly-1与Gly-3使目的蛋白含有更少的G0F及更多的G2F;Gly-3补料方案在高甘露糖修饰方面较其他两种方案更少。结论Gly-1培养基使糖基化修饰从G0F向G1F、G2F转变,Gly-2培养基使糖基化修饰从G2F、G1F向G0F转变,Gly-3培养基使糖基化修饰从G0F向G1F、G2F转变,且高甘露糖含量在5%以下。Gly-3培养基可能具有更好的修改目的蛋白糖基化类型及比例的效果。

截短型人乳头瘤病毒58型L1蛋白在昆虫细胞中的表达

目的利用昆虫细胞杆状病毒表达系统构建含截短型人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)58型主要衣壳蛋白L1基因的重组杆状病毒,并在Sf9细胞中表达。方法从NCBI中获得HPV 58 L1基因序列,应用Clustal X2软件进行序列比对后,确定相对保守的目的基因序列;人工合成HPV 58 L1基因片段,PCR法获得截短型HPV58 L1-1基因,克隆至p Fast Bac-1载体中,构建重组供体质粒p FB-HPV 58 L1-1,转化大肠埃希菌DH10Bac,构建重组Bacmid-HPV 58 L1-1,转染Sf9细胞,获得第1代(P1)重组杆状病毒BV-HPV 58 L1-1,扩增后采用快速滴定法测定病毒滴度;将重组杆状病毒感染Sf9细胞,表达HPV 58 L1-1蛋白,并进行Western blot分析和透射电镜观察。结果Bacmid-HPV 58 L1-1经PCR及测序鉴定构建正确;P2重组杆状病毒的滴度可达1.0×108 pfu/ml;HPV 58 L1-1在Sf9昆虫细胞中的表达产物经Western blot检测,可见相对分子质量约55 000的特异性反应条带,电镜观察可见L1蛋白自组装形成病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)。结论成功在昆虫细胞中表达了HPV 58 L1-1蛋白,并自组装为VLPs,为预防型HPV疫苗的研究奠定了基础。

rhGH-Fc工程细胞的构建及筛选

目的研制具有较长半衰期的长效重组人生长激素(recombinant human growth hormone,rhGH),构建并筛选出高表达rhGH-Fc免疫融合蛋白的细胞株。方法将hGH基因与特异位点突变后的人抗体IgG4Fc段用柔性linker连接,克隆至GS双表达载体上,构建重组表达质粒,经两次双酶切鉴定及测序分析后,将构建正确的质粒稳定转染CHO-k1细胞。通过逐渐提高蛋氨酸磺酰胺(methionine sulphoximine,MSX)浓度,ELISA法筛选高表达的细胞株;利用亲和层析初步纯化目的蛋白,并进行SDS-PAGE、HPLC、等电聚焦电泳分析;通过大鼠去垂体法测定长效rhGH的生物学活性,比较本课题研制的长效GH与其他普通GH的半衰期。结果重组质粒phGH-Fc-1经两次双酶切及测序鉴定,证明构建正确;成功筛选出高表达rhGH-Fc融合蛋白的细胞株,表达量可达1g/L;纯化的目的蛋白相对分子质量大小及等电点均与理论值一致,纯度可达95%以上;经大鼠去垂体体内活性测定,其比活为1.1IU/mg,依大鼠体重增长情况判断,其生物半衰期高于普通rhGH。结论成功构建并筛选出高表达长效rhGH的工程株,为后续长效rhGH的研制奠定了基础。

表达长效生长激素的CHO细胞培养工艺的优化及放大

目的在NewBrunSwick31014 L生物反应器中培养表达重组人长效生长激素(recombinant human growth hormone Fc fusion protein,rhGH-Fc)的CHO细胞,优化工艺参数以提高表达量,并进行NewBrunSwick31014 L到New-BrunSwick51040 L生物反应器的工艺放大。方法在原有14 L培养工艺基础上,调节转速、通气速率等参数,并对参数调整时期进行工艺优化。通过对渗透压、乳酸、铵离子、钾离子等代谢过程产物的检测来确保代谢正常,利用HPLC法测定表达量。再根据经验公式算出可线性放大的体积依赖型参数,保持原有培养方案及补料策略不变的情况下,结合不同放大经验方法确定操作窗口,从而进行工艺放大。结果14 L生物反应器优化工艺乳酸累积量低于20 mmol/L、最终铵离子累积量为8 mmol/L、钾离子累积量为14 mmol/L、渗透压为425 osmol/kg,降温后比耗糖速率为0.12 g/(10^(9) cells·d),表达量为0.9 g/L。经检测,放大至40 L生物反应器,整个培养过程耗糖曲线及代谢产物均与14 L生物反应器中一致,表达量为1.0 g/L。结论成功优化了rhGH-Fc工程细胞大规模培养的工艺,并进行了规模放大,为rhGH-Fc的后续开发奠定了基础。

表达长效重组人生长激素-Fc融合蛋白的CHO细胞培养工艺的优化及放大

目的优化表达长效重组人生长激素-Fc(recombiant human growth hormone-Fc,rhGH-Fc)融合蛋白的CHO细胞培养工艺,并进行初步工艺放大。方法采用7 L生物反应器培养表达rhGH-Fc融合蛋白的CHO细胞,操作参数:转速200 r/min,温度37℃,pH 7.2±0.1,溶氧值(DO)40%。通过改变对数增长期的pH(7.2±0.1降至6.9±0.1)及平台期降温幅度(37℃降至30及33℃),检测培养过程中细胞密度、细胞活率、培养液渗透压、葡萄糖及乳酸水平、以蛋白表达量为指标,优化7 L生物反应器培养工艺。应用优化的最佳工艺进行14 L线性放大,通气量分别设置为0.5、0.1及0.03 SLPM,检测蛋白表达量。结果7 L生物反应器培养工艺最佳pH为6.9±0.1,最佳温度为33℃,该工艺下蛋白表达量高达1200 mg/L;14 L生物反应器培养工艺最佳通气量为0.03 SLPM,该工艺下蛋白表达量为880 mg/L。结论成功优化了表达rhGH-Fc融合蛋白的CHO细胞7 L生物反应器的培养工艺,并实现了14 L生物反应器的放大,本实验为后续rhGH-Fc融合蛋白的大规模生产奠定了基础。

重组人白细胞介素-1受体拮抗剂生物学活性检测方法的建立及验证

目的建立重组人白细胞介素-1受体拮抗剂(interleukin-1 receptor antagonist,IL-1Ra)生物学活性检测方法,并对方法进行验证。方法根据IL-1Ra阻断IL-1β杀伤人黑色素瘤细胞A375.S2的能力评价IL-1Ra的生物学活性,结果用标准品进行校正。对方法的样品起始浓度(8、10、12、14μg/mL)和IL-1β终浓度(2、4、6 ng/mL)进行优化,并验证方法的专属性、准确度、线性范围、中间精密度、耐用性。用建立的方法检测本公司在研产品3批原液和3批成品的生物学活性。结果确定该方法的样品起始浓度为8μg/mL,IL-1β终浓度为4 ng/mL。IL-1Ra原液缓冲液成分及成品中辅料成分对检测结果无影响;线性范围为6~13μg/mL,相关系数R2为0.9921;准确度验证线性回归方程的斜率为0.9758;不同试验人员于不同时间对1批原液、1批成品检测结果的几何变异系数(geometric coefficient of variation,GCV)分别为13.895%和8.670%,均<20%;不同细胞代次、不同细胞密度下相对效价测定值的GCV为5.595%,<20%。用建立的方法检测3批原液和3批成品的结果较稳定。结论成功建立了重组人IL-1Ra生物学活性检测方法,该方法准确度高,精密度好,耐用性强,检测结果稳定可靠,可用于产品的生物学活性评价和质量控制。

重组人生长激素Fc融合蛋白工程细胞染色体核型分析

目的分析重组人生长激素Fc融合蛋白工程细胞(rhGH-CHO细胞)染色体核型。方法采用0. 1μg/m L秋水仙碱处理分裂中期的细胞,经固定、染色,制片观察,选取染色体形态及分散度较好的视野拍照。应用Image-ProPlus 6. 0(IPP)软件打开图片,利用手动测量工具(manual measurements)随机测量50个2n=22的CHO-k1和rhGH-CHO细胞中染色体长臂和短臂长度,计算各染色体的相对长度(各染色体与最长染色体长度的比值)及短臂/长臂的比值,并绘制染色体核型的B-Spline特征曲线。结果 rhGH-CHO和CHO-k1细胞的染色体数目均为22条,且染色体核型特征曲线一致。结论 rhGH-CHO细胞来源于CHO-k1细胞,且未受其他细胞污染。

实验设计在重组人生长激素-Fc融合蛋白纯化工艺建立过程中的应用

目的 通过实验设计(Design of Experiment,DOE)对重组人生长激素-Fc(recombinant human growth hormone-Fc,rhGH-Fc)融合蛋白纯化工艺中阴离子交换层析的层析条件进行优化,以降低蛋白原液中宿主蛋白(host cell protein,HCP)含量。方法 利用Minitab 19中DOE功能创建4因子2水平完全析因实验设计,通过DOE对rhGH-Fc纯化工艺中离子交换层析条件(流速、上样量、缓冲液pH、洗脱液盐浓度)进行优化,找出操作空间。结果 建立的DOE模型能准确预测实验结果,其中上样量、缓冲液pH、洗脱盐浓度以及缓冲液pH与洗脱液盐浓度的交互效应对收获液中HCP含量有显著影响。获得的最佳层析条件为:上样量15 mg/mL,流速120 cm/h,洗脱液pH 7.0~8.0,洗脱液盐浓度0.1 mol/L。该层析条件下洗脱液中HCP含量均<400 ng/mg,在确定操作空间的结果范围内满足验证要求。结论 本实验成功应用DOE确定了阴离子交换层析去除HCP的最佳层析条件,为其在生物制药领域的更多应用提供了参考。

长效重组人生长激素-Fc融合蛋白纯化工艺的建立

目的建立长效重组人生长激素-Fc(recombiant human growth hormone-Fc,rhGH-Fc)融合蛋白的纯化工艺。方法rhGH-Fc融合蛋白细胞培养液经离心、低pH处理、过滤、浓缩预处理后,再经Protein-A亲和层析、CM阳离子交换层析、Q HP阴离子交换层析进行纯化,同时检测rhGH-Fc融合蛋白的蛋白含量、纯度、等电点及宿主蛋白、宿主DNA、Protein-A残留量等指标。结果Protein-A亲和层析、CM阳离子交换层析、Q HP阴离子交换层析纯化产物的蛋白含量分别为145、132、92.4 mg,纯度分别为95.40%、95.90%和99.19%,宿主蛋白残留量分别为2500、864和71 ng/mg,宿主DNA残留量分别为329、0.56和0.12 ng/mg,Protein-A残留量分别为24.5、3.2和0 ng/mg。rhGH-Fc融合蛋白相对分子质量约97300,等电点范围为5.5~6.5,可与鼠抗人生长激素(human growth hormone,hGH)抗体发生特异性结合。结论成功建立了rhGH-Fc融合蛋白的纯化工艺,该工艺的纯化产物回收率及纯度均较高,本实验为rhGH-Fc融合蛋白的大规模生产奠定了理论基础。

重组人aFGF工程菌发酵条件的优化

目的优化重组人酸性成纤维细胞生长因子(rhaFGF)工程菌的发酵条件。方法采用分批补料方式,在菌体快速生长阶段,通过变速流加碳源和氮源,控制流加比例,调节pH值和溶解氧(DO)含量,实现工程菌的高密度发酵及目的蛋白的高效表达。结果当碳源与氮源流加比例为3:1时,菌体湿重可达145g/L,干重达36g/L,目的蛋白表达量达28.9%;DO控制在20%时,全菌体和裂解液中目的蛋白的表达量均最高,分别可达29.11%和44.28%。结论已初步优化了rhaFGF工程菌的发酵条件。

重组蛋白制品中大肠埃希菌宿主蛋白残留测定试剂盒的适用性验证

目的验证重组蛋白制品中大肠埃希菌宿主蛋白(host cell protein,HCP)残留检测试剂盒的适用性。方法对淄博云桥生物技术有限公司制备的大肠埃希菌HCP的ELISA检测试剂盒进行特异性、灵敏度、精密性、准确性验证,同时进行基质干扰试验和稀释回收试验。采用该试剂盒及一款市售进口试剂盒分别对本公司制备的3批重组碱性成纤维细胞生长因子(recombinant basic fibroblast growth factor,rbFGF)制品原液及纯化工艺中间样品的HCP残留量进行检测。结果试剂盒可特异性检测大肠埃希菌HCP残留量;线性范围为3.33~810 ng/ml;检测限和定量限均为3.33 ng/ml;试验内变异系数(CV)和试验间CV均<16%;低、中、高3个浓度样品的回收率分别为113.1%、113.7%和97.5%;原液样品基质对测定基本无影响,原液基质中DTT含量<5 mmol/L对测定结果的影响在可接受范围内;原液样品在测定HCP含量时存在干扰,稀释3倍时,干扰最小;该试剂盒与另一款市售试剂盒检测3批rbFGF制品原液及纯化工艺中间样品的HCP残留量基本一致。结论该试剂盒具有良好的特异性、灵敏度、准确性、精密度和线性,可用于本公司重组蛋白制品中大肠埃希菌HCP残留的检测。

长效生长激素相关蛋白含量检测反相高效液相色谱法的建立及验证

目的建立长效生长激素(recombinant human growth hormone-Fc,rhGH-Fc)相关蛋白含量检测的反相高效液相色谱(RP-HPLC)法,并进行验证。方法通过质谱肽图法进行rhGH-Fc相关蛋白结构解析后建立相关蛋白含量检测的方法,优化梯度洗脱方法和流动相方案,并对该方法进行重复性、专属性、耐用性验证,确定检测限和定量限。用建立的方法检测rhGH-Fc氧化加速试验样品、脱酰胺加速试验样品及不同批次纯化液样品。结果建立的RP-HPLC法色谱柱为ZORBAX 300SB-C18(4.6 mm×250 mm,5-Micron),柱温45℃,上样量40μg,流速0.7 mL/min,检测波长280 nm;流动相A为30%乙腈+0.1%三氟乙酸,流动相B为80%乙腈+0.1%三氟乙酸;梯度洗脱方法为0~10 min,10%B→50%B;10~50 min,50%B→90%B。rhGH-Fc的相关蛋白主要产生在4个氧化位点和2个脱酰胺位点处。建立的RP-HPLC检测方法重复性验证RSD为1.8%;蛋白缓冲液对检测结果无干扰;耐用性验证RSD为0.05%;在相同色谱柱条件下,不同设备、不同时间配制的流动相、不同柱温对检测结果无明显影响;方法检测限为0.01 mg/mL,定量限为0.025 mg/m L。结论成功建立了rhGH-Fc相关蛋白含量的RP-HPLC检测方法,该方法重复性、专属性、耐用性良好,可用于rhGH-Fc相关蛋白含量的检测。