慢病毒载体介导PAX6沉默引起HLE-B3细胞凋亡

目的:观察PAX6基因沉默后人晶状体上皮细胞系(HLE-B3)增殖的改变。方法:分别将4组PAX6 shRNA慢病毒载体及对照组慢病毒(pGCL-GFP-shRP1,2,3,4,NC)感染B3细胞;感染96h后,利用Real-time PCR和Western-blot检测B3细胞PAX6表达以确定PAX6沉默;选取有效沉默PAX6基因的pGCL-GFP-shRP4感染B3细胞,MOI=10,观察细胞数量变化。感染48h后采用流式细胞仪检测B3细胞凋亡情况。结果:感染RNAi病毒组的B3细胞,随感染时间延长,细胞数量减少。流式细胞仪检测结果显示沉默PAX648h的B3细胞,G1/G0期前出现凋亡峰。结论:慢病毒介导的RNA干扰能有效沉默B3细胞的PAX6表达;PAX6基因沉默后B3细胞凋亡。

高毒性人呼吸道合胞病毒鼠适应株的筛选

目的以BALB/c小鼠作为动物模型筛选高毒性人呼吸道合胞病毒鼠适应株。方法以连续传代法经小鼠下呼吸道接种临床株人呼吸道合胞病毒hRSV-A-GZ08-0,确认8月龄BALB/c雄鼠作为人呼吸道合胞病毒动物模型较3周龄BALB/c小鼠和8月龄BALB/c雌鼠更佳后,以8月龄BALB/c雄鼠为动物模型,将hRSV-A-GZ08-0连续传代50代,分离获得1株鼠适应株hRSV-A-GZ08-P50-4,该株病毒与临床株hRSV-A-GZ08-0分别接种8月龄BALB/c雄鼠后第3d以TCID50方法测定鼠肺灌洗液中的病毒滴度,并作鼠肺病理切片比较两株病毒感染的不同。结果8月龄BALB/c雄鼠作为人呼吸道合胞病毒动物模型较3周龄BALB/c小鼠和8月龄BALB/c雌鼠更佳。与临床株hRSV-AGZ08-0比较,hRSV-A-GZ08-P50-4为高毒性hRSV鼠适应株。结论 8月龄BALB/c小鼠,特别是8月龄BALB/c雄鼠,可作为动物模型筛选高滴度hRSV鼠适应株。筛选到的高毒性hRSV鼠适应株hRSV-A-GZ08-P50-4致病力较强。

人PAX6基因shRNA慢病毒载体的构建及鉴定

目的体外构建人PAX6基因的shRNA慢病毒载体并鉴定。方法实验研究。设计PAX6基因特异性siRNA靶点,构建PAX6 shRNA重组质粒,构建表达FLAG tag、PAX6以及红色荧光蛋白报告基因的融合蛋白表达质粒,经Western Blot加以验证,使用293T细胞进行有效靶点的外源筛选。构建慢病毒pGCL-GFP载体,在293T细胞中包装病毒,将shRNA重组病毒感染人晶状体上皮细胞系(HLE-B3),检测B3细胞PAX6蛋白表达情况,从而筛选有效靶点。根据PAX6基因的4个候选RNAi靶序列,构建shRNA重组质粒,并构建FLAG tag、PAX6、红色荧光蛋白融合蛋白的表达系统。结果经验证外源PAX6基因,发现3个候选靶点是有效的RNAi靶点,能使PAX6蛋白表达水平显著降低。在此基础上构建的PAX6 shRNA重组慢病毒载体,显著抑制了HLE-B3细胞PAX6蛋白的内源性表达。结论成功构建了人PAX6基因的shRNA慢病毒表达载体,在分子水平能够有效沉默靶基因,为后续探讨PAX6对晶状体上皮细胞的生物学作用奠定了基础。