七鳃鳗遗传多样性与演化研究进展

七鳃鳗(Petromyzonidae)是目前已知最古老的脊椎动物中惟一的幸存者。对其资源保护和演化发育生物学的研究正日益受到重视。本文从染色体、蛋白质和DNA水平总结近年来七鳃鳗遗传多样性与演化方面的研究进展。重点介绍了限制性酶切片段长度多态性、DNA随机扩增多态性、DNA扩增片段长度多态性、微卫星DNA标记等技术及线粒体DNA和功能基因研究应用于七鳃鳗种群遗传多样性、遗传分化、遗传结构、种质鉴定与渔业资源管理及系统进化等方面的新进展。

利用引物退火控制技术克隆日本囊对虾性腺差异表达基因

为了解日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)性腺发育及分化的分子机制,本研究采用改良的引物退火控制技术克隆到了共8个精巢、卵巢的差异表达基因.其中4个为已知基因,分别为凝血酶敏感蛋白基因、皮质棒蛋白基因、增殖细胞核抗原基因和泛素缀合酶基因;4个为未知基因,分别命名为MjACP3-T、MjACP4-T、MjACP15-T和MjACP4-O基因.采用实时定量PCR方法分析了4个未知基因在性腺发育过程的表达谱,结果表明:MjACP3-T、MjACP4-T和MjACP15-T基因在日本囊对虾精巢和卵巢中的表达量有显著差异,且在各个时期精巢的表达量均高于卵巢,说明这3个基因可能在精巢的发育中起到某些重要作用.卵巢MjACP4-O基因的表达量变化较大,第5期卵巢的相对表达量达到最高(为1.38),而其他各个阶段的变化较大,在第4期卵巢的相对表达量最低(为0.03).在精巢中,MjACP4-O基因的表达量随着精巢逐渐发育成熟呈下降趋势.定量PCR结果与引物退火控制技术的结果有着很好的一致性.研究结果表明,引物退火控制技术是一种简单高效的克隆差异表达基因的技术.采用该技术所克隆到的8个精巢、卵巢的差异表达基因,为进一步了解日本囊对虾性腺发育分化的分子机制提供了基础材料.

大黄鱼性腺线性化cDNA文库的构建及生殖免疫相关基因的筛选

以大黄鱼(Larimichthys crocea)性腺为材料,采用SMART(switching mechanism at 5′end of RNA transcript)技术和DSN(duplex-specific nuclease)处理构建了大黄鱼性腺线性化cDNA文库,文库的库容为4.3×106PFU/mL,重组率为95.8%,插入片段大小为0.5-3 kb,说明该文库质量良好。从文库中随机挑取了3 961个克隆进行测序,共获得3 535条高质量的表达序列标签(ESTs)。包含与生殖免疫相关的基因33条,其中非特异性免疫相关基因17条,特异性免疫相关基因16条。

杂色鲍β-1,3-葡聚糖识别蛋白基因的克隆和表达

从杂色鲍(Haliotis disversicolor)的表达序列标签(EST)中首先鉴定出β-1,3-葡聚糖识别蛋白基因片段(beta-1,3-glucan recognition protein,saβgrp)。通过5′RACE获得5′端序列,并用由头至趾(head to toe)PCR方法检测全长cDNA序列的正确性。saβgrp的cDNA全长为1 459 bp,包括387 bp的5′非编码区,987 bp的开放阅读框,85 bp的3′非编码区。saβgrp开放阅读框编码328个氨基酸。与现有报道的β-1,3-葡聚糖识别蛋白均含信号肽不同,本研究所获得的杂色鲍saβGRP不含信号肽,为非分泌型蛋白。实时定量PCR分析表明:经副溶血弧菌诱导后,24 h的实验组saβgrp的表达水平极显著高于对照组(P<0.01),48 h的实验组saβgrp基因显著高于对照组(P<0.05)。

凡纳滨对虾DNaseⅠ基因的克隆及原核表达

利用RT-PCR和RACE技术,从凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)肝胰腺中克隆了DNaseⅠ基因的全长cDNA序列。该序列全长1614bp,包含1209bp的开放阅读框,编码一个含403个氨基酸的蛋白;5′非翻译区为116bp,3′非翻译区为289bp。实时定量PCR分析结果表明,DNaseⅠ基因在肝胰腺的表达量是其他器官表达量的16～162倍,表明凡纳滨对虾DNaseⅠ基因属于胰腺型表达。本研究还利用酶切重组构建原核表达载体,并在大肠杆菌(Escherichia coli)中成功表达出了有活性的重组DNaseⅠ蛋白。