DEN诱发大鼠肝癌过程中肝组织基因表达谱的演变

目的:揭示肝癌诱发过程中肝组织基因表达谱的演变,为中医药防治原发性肝癌提供参考。方法:采用DEN诱发大鼠肝癌,分别于诱癌的第4周、8周、16周、20周(肝癌形成)切取肝(合肝癌)组织,常规提取RNA,Affymetrix Rat 230A GeneChip及技术检测大鼠肝组织基因表达的差异和演变。结果:在芯片的15710个基因中,正常组有9225个基因表达,诱癌4周表达增至9396个,8周增至9872个,16周增至10496个,20周有10420个。在肝癌诱发过程中,存在大量基因表达的消长以及高表达基因数的增加,其中部分已知基因的结果。结论:DEN诱发大鼠肝癌过程中基因组变化是十分复杂的,而且文献追踪表明,国内外对在这些基因的功能及其与肝癌发生、发展的关系大多不明确。因此,如何逐一找到那些起着关键作用的基因,进一步阐释其在肝癌的发生、发展和转归中的作用,及其与中医证候演变和相应治法的关系,是今后中医基础理论实验研究的重要方向。

不同证候H22荷瘤小鼠垂体一致上调或下调的基因

目的:观察常见不同证候荷瘤小鼠垂体基因表达的特征。方法:采用H22荷瘤小鼠及其标准化四诊及辨证方法,以及GeneChip Mouse Exon 1.0 ST Array等技术,检测荷瘤小鼠早期邪毒壅盛证和气虚证、中期阳气虚证、中晚期气阴阳虚证等4个证候及正常小鼠垂体基因的表达,筛选出不同证候一致上调或下调的基因。结果:荷瘤小鼠一致上调的基因有Alas2、Ube2l6、Sgk、BC055107、Cdh26、Bhlhb2、Nr1d2、Slc39a14、Serpina3n、Ms4a6c、Lcp1、Dhx8、Il1r1、S100a8、S100a9、Cxcl1、Hp、Csf1r、RIKEN cDNA2610307008gene、Phactr3、Mknk1、Aloxe3、Aqp11等23个;一致下调的基因有2310047A01Rik、Hoxa10、Cryaa、Hspa1a、Dub2a、Mpz、Klk1、Naaladl1、Prph1等9个;其中部分基因在一些证候中的表达有显著的改变。结论:肿瘤发生后,H22荷瘤小鼠垂体存在大量基因表达的差异,其中部分与证候有关。

大鼠肝癌肿瘤转移相关基因的表达及不同中医治法作用

目的:观察肿瘤转移相关基因及转移抑制基因在DEN诱发大鼠肝癌组织中的表达及不同治法对其影响。方法:DEN诱发大鼠肝癌,经西药喃氟啶和不同中药治疗,取大鼠肝(含肝癌)组织抽提RNA,Affymetrix Rat 230A GeneChip检测基因表达的差异。结果:肝癌表达增加者55个,减少者8个,不同中西医治法有一定的调节作用。分析:肿瘤转移相关基因及转移抑制基因在肝癌中表达的改变和不同治法作用的差异,其具体调节途径和意义有待进一步研究。

健脾理气法下调大鼠肝癌信号转导有关基因转录水平的筛选

目的:筛选出健脾理气法明显下调大鼠肝癌组织中与信号转导有关的基因。方法:以DEN诱导大鼠肝癌形成为模型,以西药喃氟啶化疗、中医清热解毒、活血化瘀治法为对照治疗,采用基因芯片技术,观察健脾理气法对大鼠肝癌组织基因组转录水平及信号转导相关基因转录的调控作用。结果:①与模型组比较,各中医治法下调最明显的基因分别为:清热解毒法明显下调140个基因,活血化瘀法明显下调186个基因,健脾理气法明显下调689个基因;②在健脾理气法明显下调的163个已知基因中,筛选出19个与信号转导相关的基因。讨论:基因芯片很好地揭示了不同中医治法各自防治肝癌的分子作用靶点,其中,健脾理气法下调大鼠肝癌组织与信号转导有关的基因转录中,涉及到细胞信号转导网络的多条通路的多个环节。

大鼠肝癌高表达基因cDNA序列的克隆

目的克隆出大鼠肝癌高表达EST片段相关基因的cDNA完整表达序列,为进一步揭示其生物学功能奠定基础。方法通过基因芯片检测出DEN诱发的大鼠肝癌高表达的EST片段;其中部分高表达的EST片段,采用电子克隆与PCR相结合的方法,克隆出其cDNA完整表达序列。结果与正常大鼠肝组织比较,肝癌组织中明显高表达的EST片段有34个。采用EST电子克隆技术与PCR技术相结合的方法,成功克隆出4个EST片段的cDNA序列,经进一步BLAST对比分析,证明G15、G20、G36、G40等4个基因为新基因,并进行GenBank登录,登录号分别为DQ480746、DQ480747、DQ480744、DQ912022。结论利用大鼠基因芯片高通量地筛选出DEN诱发的肝癌组织高表达的有关基因,并在充分利用生物信息学资源的基础上,成功克隆出4个新基因的cDNA序列,为今后进一步深入观察这些基因的功能及其在肝癌发生、发展过程中的作用机制打下良好的研究基础。

正常气虚小鼠下丘脑-垂体-睾丸轴相关基因转录的特征

目的:观察正常气虚小鼠下丘脑-垂体-睾丸轴与睾酮合成调节相关基因的转录特征。方法:采用小鼠标准化诊法和辨证方法,筛选出正常气虚小鼠与正常小鼠,采用GeneChip Mouse Exon 1.0 ST Array等技术,检测其下丘脑-垂体-睾丸轴有关基因的转录水平。结果:与正常对照小鼠比较,正常气虚小鼠下丘脑Gnrh1表达略增;垂体上Gnrh受体上调,但Cga、Fshb和Lhb下调;睾丸Cyp11a1、Cyp17a1、Hsd3b1、Hsd3b6等与睾酮合成相关酶一致上调。结论:正常小鼠出现气虚证时,垂体促性腺激素表达量略减,而睾丸合成睾酮的系列关键酶的表达活跃,这构成了正常气虚证小鼠下丘脑-垂体-睾丸轴的特征。

H_(22)荷瘤小鼠早期垂体差异表达的基因及其特征

目的:筛选荷瘤小鼠早期垂体差异表达的基因,并简要分析其功能特征。方法:采用荷瘤小鼠标准化四诊及辨证方法,及GeneChip Mouse Exon1.0STArray等技术,检测H22荷瘤小鼠早期邪毒壅盛证和气虚证、中期阳气虚证、中晚期气阴阳虚证共3阶段4个证候垂体基因表达的差异,重点关注早期垂体差异表达的基因。结果:筛选到早期上调的基因12个:Alb1、Timp3、Ifi44、Kdr、Cbln3、Hectd2、Hecw2、Vtn、LOC631028、LOC630776、4933427I04Rik、A630075K04Rik。下调的基因17个:Klk1b27、Klk1b26、Klk1b4、Klk1b22、Klk1b3、Klk1、Klk1b16、Muc10、Cryaa、Bag3、Gsg2、Six2、Saa3、1700108L22Rik、LOC628820、2310057J18Rik、2410002I01Rik。结论:H22荷瘤小鼠早期垂体基因表达改变集中表现为保护蛋白的功能减弱、细胞周期改变,以及血管、神经、表皮生成存在障碍的倾向,这可能与荷瘤小鼠早期垂体应激代偿,甚至是失代偿有关。其中Cbln3可能是邪毒壅盛证的标志基因之一。

RNAi研究CK18在肝癌增殖中的作用及不同中医治法的调节

目的:观察不同中医治法对大鼠肝癌CK18表达的调控差异,以及CK18在人肝癌细胞增殖中的作用。方法:(1)采用DEN诱发大鼠肝癌,分别经中药健脾益气、清热解毒、活血化瘀等治疗后,检测肝癌组织CK18表达的差异;(2)设计2个人CK18基因siRNA靶点,将重组质粒电转入SMMC-7721人肝癌细胞株,MTT法检测细胞生长增殖情况、Realtime-PCR检测该基因的表达差异。结果:(1)芯片结果显示,CK18基因在大鼠肝癌形成后表达显著增加,不同中医治法对其具有不同程度的轻度调控作用,其中健脾益气治法下调作用较明显;(2)采用MTT法筛选到一个CK18基因RNA干扰有效靶序列,转染144h后细胞的生长增殖得到了明显的抑制;(3)实时荧光定量PCR检测表明,转染72h后该基因的表达已明显降低。结论:肝癌细胞恶性增殖有赖于CK18基因的高表达,目前常用治法对该基因的调控作用有限,因而该基因可望作为肝癌疗效筛选评价指标。

MT1E在肝癌细胞中的作用及不同中医治法对其表达调控的差异研究

目的:比较常用不同中医治法对MT1E表达调控作用的差异,以及初步探讨MT1E在肝癌细胞中的生物学功能。方法:(1)以DEN诱发大鼠肝癌形成为模型,应用基因芯片检测健脾益气、清热解毒、活血化瘀等常用中医治法对MT1E基因表达的差异;(2)针对MT1E基因mRNA序列设计2个siRNA靶点,分别经质粒重组后电转入SMMC-7721肝癌细胞株中,用实时荧光定量PCR技术检测MT1E基因的表达情况,用MTT法检测细胞生长增殖情况。结果:(1)芯片结果显示,MT1E基因在肝癌形成后表达明显增加,不同中医治法对其具有不同程度的调控作用,其中健脾益气法的下调作用最明显;(2)成功筛选到MT1E基因RNA干扰的1个有效靶序列,经实时荧光定量PCR技术检测到电转染72h后,该基因的表达水平明显降低;(3)MTT的结果显示,有效干扰靶点电转染144h后细胞的生长增殖得到了明显的抑制。讨论:MT1E基因是中医健脾益气法防治原发性肝癌的有效靶点之一,经生物学功能研究表明,该基因的高表达与肿瘤细胞的恶性增殖有关。

不同中医治法对肝癌大鼠肝组织中细胞内信号转导蛋白激酶级联分子的影响

目的探讨不同中医治法对细胞内蛋白激酶级联分子的影响。方法采用A ffym etrix Rat 230A GeneCh ip检测了二乙基亚硝胺(DEN)诱导的大鼠肝癌模型组、不同中医治法组和西医治法组肝癌(含肝)组织,以及正常组肝组织基因表达谱的改变,根据有关基因功能分类的方法,筛选模型组表达大于正常而经过各种治法治疗后表达小于模型组的细胞内信号转导蛋白激酶级联分子。结果西药组下调显著3个基因,中医全方、清热、活血和健脾治法分别下调的3、2、2和3个基因。结论不同中医治法调节的靶点基因是不同的。

不同证候小鼠下丘脑-垂体-甲状腺轴基因表达的特征

目的:观察不同证候小鼠下丘脑-垂体-甲状腺轴(HPTA)相关主要已知基因表达的特征。方法:采用小鼠计量化四诊和辨证方法、及GeneChip Mouse Exon 1.0 STArray等技术,观察正常偏气虚证小鼠、早期邪毒壅盛证和早期气虚证荷瘤小鼠HPTA相关基因表达差异。结果:(1)正常小鼠气虚证者,甲状腺机能减退,Atp1a1、Atp1a2、Atp1a3、Atp1b1、Atp1b2、Pax8、Tg、Tpo、NIS等与甲状腺素合成有关基因的表达水平一致下降;而垂体、下丘脑处于积极的代偿之中,TRH、TSH等激素表达增加。(2)肿瘤发生后的早期,荷瘤小鼠亦出现甲状腺机能的减退,垂体、下丘脑亦处于积极的代偿之中,TRH、TSH等激素表达增加。但是,该阶段邪毒壅盛证小鼠,垂体已出现失代偿的征兆,TSHb的表达量已显著低于同期的气虚证以及正常气虚小鼠。结论:甲状腺机能减退可能是气虚证发生的重要基础,而非下丘脑和垂体。荷瘤小鼠早期邪毒壅盛证垂体继发的失代偿表现,可能与该证候荷瘤小鼠带瘤生存期短、预后差有关。

邪毒壅盛证和气虚证荷瘤小鼠垂体上调与下调的基因

目的:揭示荷瘤小鼠早期邪毒壅盛证与气虚证垂体基因表达的差异。方法:采用小鼠标准化四诊及辨证方法,及GeneChip Mouse Exon 1.0 ST Array等技术,检测H22荷瘤小鼠早期邪毒壅盛证和气虚证、中期阳气虚证、中晚期气阴阳虚证3阶段4个证候垂体的基因表达,筛选邪毒壅盛和气虚两证候垂体基因表达与正常比较一致上调或下调的基因。结果:①邪毒壅盛证和气虚证垂体表达上调的基因有5个,其中邪毒壅盛证Alas2、Sgk、Cbln3表达高,十分突出,可能与该证候形成有关;②邪毒壅盛证和气虚证的垂体有13个基因表达几乎关闭,其中Abpg、Pip,以及Car6、Klk1b22、Klk1b3、Klk1b9、Muc10、Ren1、Hspa1a、Wfdc12等基因在正常组表达量大。结论:荷瘤小鼠垂体早期出现显著的衰退表现,而个别基因表达的增加,可能与邪毒壅盛有关。

RNAi研究角蛋白18在肝癌增殖中的作用及不同中医治法的调节

目的观察不同中医治法对大鼠肝癌角蛋白18(CK18)表达的调控差异,及其在人肝癌细胞增殖中的作用。方法 (1)采用DEN诱发大鼠肝癌模型,分别经中药健脾益气、清热解毒、活血化瘀等治法治疗后,检测肝癌组织(和正常肝组织)CK18表达的差异;(2)设计2个人CK18基因siRNA靶点,将重组质粒电转入SMMC-7721人肝癌细胞株,MTT法检测细胞生长增殖情况、Realtime-PCR检测该基因的表达差异。结果 (1)芯片结果显示,CK18基因在大鼠肝癌形成后表达显著增加,不同中医治法对其具有不同程度的轻度调控作用,其中健脾益气治法下调作用较明显;(2)采用MTT法筛选到一个CK18基因RNA干扰有效靶序列,转染144h后细胞的生长增殖得到了明显的抑制;(3)实时荧光定量PCR检测表明,转染72h后该基因的表达已明显降低。结论肝癌细胞恶性增殖有赖于CK18基因的高表达,目前常用治法对该基因的调控作用有限,因而该基因可望作为肝癌疗效筛选评价指标。

RNAi检测IFRD1在肝癌增殖中的作用及不同中医治法的调节

目的:观察不同中医治法对大鼠肝癌干扰素相关发育调节因子1(IFRD1)表达的调控差异,以及IFRD1在人肝癌细胞增殖中的作用。方法:(1)采用二乙基亚硝胺(DEN)诱发大鼠肝癌,分别经中药健脾益气、清热解毒、活血化瘀等治疗后,Affymetrix rat 230A GeneChip arrays检测肝癌组织IFRD1表达的差异;(2)设计3个人IFRD1基因siRNA靶点,将重组质粒电转入SMMC-7721人肝癌细胞株,MTT法检测细胞生长增殖情况、Realtime-PCR检测该基因的表达差异。结果:(1)芯片结果显示,IFRD1基因在大鼠肝癌形成后表达显著增加,不同中医治法对其具有不同程度的下调作用,其中活血化瘀治法下调作用较明显,对照西药化疗反而具有上调作用;(2)采用MTT法筛选到1个IFRD1基因RNA干扰有效靶序列,转染144h后细胞的生长增殖得到了明显的抑制(与阴性对照组相比,P<0.01);(3)实时荧光定量PCR检测表明,转染72h后该基因的表达明显降低。结论:SMMC-7721肝癌细胞恶性增殖有赖于IFRD1基因的高表达,而中药活血化瘀治法对其具有下调作用。

组蛋白去乙酰化酶抑制剂在多发性骨髓瘤治疗中的研究进展

组蛋白去乙酰化是基因表达的一种重要的表观遗传学调控方式。组蛋白去乙酰化酶抑制剂通过调节组蛋白和其他蛋白的乙酰化/去乙酰化状态,影响基因的表达和细胞功能。多发性骨髓瘤发生和发展过程中存在表观遗传学调节异常,组蛋白去乙酰化酶抑制剂对多发性骨髓瘤的治疗有显著效果,但是其作用的分子生物学机制尚不清楚。本文对组蛋白去乙酰化酶抑制剂治疗多发性骨髓瘤的作用机制及其临床应用作一综述。

中医不同治法对成纤维细胞生长因子在大鼠肝癌中表达的影响

目的:观察成纤维细胞生长因子(FGF)在二乙基亚硝胺(DEN)诱发大鼠肝癌组织中的表达及不同中医治法的作用。方法:采用DEN诱发大鼠肝癌,随机分为正常组、模型组、喃氟啶组、抑癌扶正行气活血法组、清热解毒法组、行气活血法组、健脾扶正法组,应用Affymetrix Rat230A GeneChip及相关技术检测各组肝脏(含肝癌)FGF基因表达的差异。结果:Rat230A芯片中有24个FGFs、3个FGFRs、1个FGFBP,其中肝癌表达增加者15个,减少者13个。FGF13芯片读数(肝癌形成/正常肝脏)为10.8,FGF7芯片读数(正常肝脏/肝癌形成)为13.1。近10年有关FGFs文献857篇,涉及肝癌者仅49篇,仅3个基因(FGF1、FGF2及FGFR3)涉及。结论:FGFs基因在大鼠肝癌中的表达有一定意义,不同治疗方法对其表达水平存在差异。

不同证候H22荷瘤小鼠肿瘤ABC转运蛋白家族基因转录特征

目的:观察不同证候H22荷瘤小鼠肿瘤组织ABC转运蛋白家族基因表达的特征。方法:对来源于早期邪毒壅盛和单纯气虚、中期阳气虚和中晚期气阴阳虚四种证候小鼠H22肿瘤组织4张Affymetrix GeneChip Mouse Exon 1.0 STArray数据标准化处理后,筛选其中的ABC转运蛋白基因进行差异分析。结果:从芯片中共筛选出与ABC转运蛋白有关的基因47个,以邪毒壅盛小鼠肿瘤基因转录最活跃,气虚次之,阳气虚最低;四种常见证候间共有25个基因转录具有明显差异;Abce1和Abcf1等7个基因中在四种常见证候肿瘤中转录水平最高。结论:Tap1(Abcb2)和Abcd2等6个高表达基因可能是邪毒壅盛型小鼠肿瘤增长快的重要因素;不同证候荷瘤小鼠肿瘤组织中的ABC转运蛋白基因转录既存在一定共性又存在很大差异,进一步证明了H22荷瘤小鼠证候客观存在的物质基础,为中医辨证论治提供分子依据。

气虚证H_(22)荷瘤小鼠甲状腺独特上下调基因的表达特征

目的:揭示荷瘤小鼠气虚证甲状腺基因表达的特征。方法:采用荷瘤小鼠及其标准化四诊及辨证方法,应用GeneChip Mouse Exon1.0STArray等技术,检测H22荷瘤小鼠早期邪毒壅盛证和气虚证、中期阳气虚证、中晚期气阴阳虚证共3阶段4个证候甲状腺基因表达的差异,重点关注早期气虚证上下调且表达量高的基因。结果:气虚证荷瘤小鼠甲状腺独特上调基因有33个,其中表达较高的基因6个,分别为Mta2d1、Comd3、Ucp1、Psmc6、LOC665964、Cyp2j11;独特下调的基因有31个,其中正常组表达较高的基因有5个,分别为Lcn2、Arntl、Mansc1、Hk1、Rpl29。结论:肿瘤发生后,H22荷瘤小鼠甲状腺存在大量的基因表达改变,其中早期气虚证独特上调或下调基因,可能与气虚证本质有关。