TLR4基因敲除小鼠对噪声性耳蜗损伤的反应

目的揭示Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)基因缺失对噪声性耳蜗感觉细胞损伤,听觉功能障碍和耳蜗免疫活力的影响作用,探讨噪声性耳蜗损伤的免疫炎性机制。方法将TLR4基因敲除(TLR4 KO)小鼠接触持续噪声暴露(1-7kHz,120dB SPL)1小时,以噪声暴露的野生型(WT)小鼠为对照,检测噪声暴露前和噪声暴露后25天四个频率短纯音(4 kHz、8 kHz、16 kHz和32 kHz)诱发的小鼠双耳ABR阈值。噪声暴露后1天,25天处死动物,解剖取双侧耳蜗。采用白细胞共同抗原(CD45)荧光免疫抗体标记噪声暴露前和噪声暴露后1天耳蜗基底膜免疫细胞,鬼笔环肽(phalloidin)染色噪声暴露前和噪声暴露后25天耳蜗基底膜毛细胞纤毛、表皮板的丝状肌动蛋白。荧光显微镜下观察噪声暴露后TLR4 KO小鼠和WT小鼠耳蜗基底膜组织的巨噬细胞、单核细胞和毛细胞形态变化,计数耳蜗基底膜外毛细胞的缺失数目。结果噪声暴露后1天,WT和TLR4 KO小鼠耳蜗基底膜均呈现单核细胞渗入。噪声暴露后25天,不同频率短纯音诱发的TLR4 KO小鼠ABR阈移和耳蜗基底膜外毛细胞缺失数目均低于WT小鼠(F=71.590, df=1,90, P<0.001;Tukey test, P<0.001),(F=8.996, df=1,17, P=0.008;Tukey test, P=0.008)。结论噪声暴露后TLR4基因缺失没有阻止单核细胞渗入耳蜗基底膜,但减轻噪声暴露后耳蜗感觉细胞和听功能损伤的程度。

耳蜗基底膜组织巨噬细胞对噪声的反应

目的观察强噪声暴露后耳蜗基底膜组织巨噬细胞形态的变化,探讨噪声性耳蜗损伤的免疫机制。方法将C57BL/6J小鼠接触持续噪声暴露(1-7k Hz,120d B SPL)1小时。应用电位反应测听仪,检测噪声暴露前和噪声暴露后10天不同频率短纯音(4、8、16和32 k Hz)诱发的动物双耳听性脑干反应阈值(ABR)。噪声暴露后1、4和10天处死动物,解剖取双侧耳蜗。采用鬼笔环肽(phalloidin)染色噪声暴露后10天毛细胞纤毛、表皮板的丝状肌动蛋白。白细胞共同抗原(CD45)荧光免疫抗体标记噪声暴露后1、4和10天耳蜗基底膜免疫细胞。以未接触噪声暴露动物耳蜗为对照,荧光显微镜下观察噪声暴露后小鼠耳蜗基底膜毛细胞和巨噬细胞形态变化,自耳蜗顶回到底回计数全耳蜗基底膜缺失的毛细胞和CD45荧光染色阳性细胞。结果噪声暴露后10天,不同频率短纯音诱发的ABR阈值均升高(F=1622.754,df=1,104,P<0.001;Tukey test,P<0.001)。耳蜗基底膜外毛细胞缺失数目明显多于正常对照组,底回缺失的外毛细胞数目多于顶回(F=92.484,df=1,40,P<0.001;Tukey test,P<0.001)。荧光显微镜下观察,生理条件下CD45阳性细胞主要为巨噬细胞,巨噬细胞分布于全耳蜗基底膜底面(鼓阶面)。细胞呈现多种形态,不同形态与其在耳蜗的不同部位相关。噪声暴露后1天,单核细胞渗入耳蜗基底膜,主要分布于耳蜗基底膜底回的上部。噪声暴露后4天,侵润的单核细胞转化为巨噬细胞,耳蜗基底膜CD45阳性细胞数目明显增加(F=15.205,df=3,46,P<0.001;Tukey test,P<0.001),耳蜗底回CD45阳性细胞数目多于顶回(P<0.05)。噪声暴露后10天,耳蜗基底膜CD45阳性细胞数目减少至噪声暴露前水平。结论免疫细胞参与了噪声性耳蜗损伤的反应,单核细胞的移入和转化可能在耳蜗细胞损伤和修复中起到重要的作用。

小鼠出生后早期耳蜗柯蒂氏器巨噬细胞形态的变化

目的揭示小鼠出生后早期耳蜗柯蒂氏器是否存在巨噬细胞及柯蒂氏器巨噬细胞形态和分布的变化。方法选1~4周龄的C57BL/6J小鼠,解剖取耳蜗基底膜。CD45抗体(一种全白细胞标记物)染色耳蜗基底膜,F4/80(巨噬细胞专有蛋白标记物)确认巨噬细胞,碘化丙锭标记细胞核,荧光显微镜下观察CD45染色阳性细胞的形态和分布变化。结果在出生后早期,小鼠耳蜗基底膜的中阶面柯蒂氏器存在巨噬细胞,巨噬细胞胞体及细胞核呈不规则形状。巨噬细胞定位于Hensen与Claudius细胞之间,分布于全耳蜗基底膜。自小鼠出生后第17天开始,一些巨噬细胞出现核消失,留下无核的细胞残余体。巨噬细胞的退变从耳蜗的底回向顶回发展。出生后1~2周小鼠耳蜗基底膜顶回、中回和底回的巨噬细胞长轴的平均直径均大于出生后3~4周小鼠(P=0.006,P=0.043,P=0.001,t检验)。结论出生后早期小鼠耳蜗柯蒂氏器存在巨噬细胞,随着感觉上皮发育成熟,这些细胞出现发育性死亡。推论柯蒂氏器巨噬细胞自耳蜗基底膜底回到顶回梯度的退化可能在耳蜗感觉上皮的发育中起到一定的作用。

不同强度噪声刺激后灰鼠耳蜗外毛细胞死亡方式观察

目的 观察在不同强度噪声刺激后灰鼠耳蜗凋亡和坏死的外毛细胞数量。方法 将灰鼠暴露于104dB或108dB SPL的4kHz窄带噪声1h,分别于噪声刺激后1、4、30天解剖取耳蜗,应用细胞核DNA染料碘化丙锭(PI)标记鉴别细胞死亡模式,原位末端标记法(TUNEL)和Caspase 3染色进一步确认凋亡和坏死的毛细胞,荧光显微镜下观察计数。结果 104dB噪声刺激后1天,108dB噪声刺激后1、4天,凋亡的外毛细胞数量明显多于坏死(P<0 05);104dB噪声刺激后4、30天,108dB噪声刺激后30天,凋亡的外毛细胞数量虽多于坏死,但差异无统计学意义(P>0 05)。噪声刺激30天后,依然存在凋亡和坏死的毛细胞。结论 外毛细胞凋亡为强噪声刺激后灰鼠耳蜗基底膜损伤早期细胞死亡的主要方式,噪声性毛细胞死亡过程至少延续至噪声刺激后30天。

强脉冲噪声暴露后耳蜗毛细胞死亡的信号通路

目的通过检测3种半胱氨酸蛋白酶(caspase-3、caspase-8和caspase-9)在耳蜗基底膜的活性变化,揭示强脉冲噪声暴露后耳蜗毛细胞死亡的信号通路。方法成年灰鼠27只,随机分为实验组和对照组。接受噪声暴露的实验组动物共15只,3种半胱氨酸蛋白酶荧光标记动物各5只。未经噪声暴露的对照组动物共12只,3种半胱氨酸蛋白酶荧光标记动物各4只。将动物暴露于平均压力峰值级为155dB SPL的脉冲噪声75次,噪声暴露后2h,用微量注射器分别将新鲜配制的3种半胱氨酸蛋白酶荧光染色液30μl缓慢注入动物双侧内耳。耳蜗内灌注后1h,动物断头,取出双耳听泡,分离耳蜗基底膜。采用细胞核DNA荧光染料碘化丙锭(PI)对耳蜗基底膜毛细胞核进行染色,荧光显微镜下观察强脉冲噪声暴露后的耳蜗基底膜凋亡、坏死毛细胞3种半胱氨酸蛋白酶荧光染色的变化。结果对照组灰鼠的耳蜗毛细胞核周围未见3种半胱氨酸蛋白酶阳性荧光标记物。实验组噪声暴露后耳蜗基底膜以核固缩、核碎裂为特征的凋亡外毛细胞核周围存在caspases-3、caspases-8和caspases-9绿色荧光标记物,而以核肿胀为特征的坏死外毛细胞核周围未见3种半胱氨酸蛋白酶阳性荧光标记物。结论强脉冲噪声暴露后耳蜗毛细胞凋亡同时通过caspases-9相关的内源性和caspases-8相关的外源性两条信号通路启动完成,而毛细胞坏死则是通过非caspases途径激活的。

三种检测耳蜗毛细胞死亡模式方法的比较

目的评估三种检测耳蜗毛细胞死亡模式方法的优缺点。方法以噪声暴露诱导灰鼠耳蜗毛细胞死亡,采用DNA荧光染料碘化丙锭(Propidiumiodide,PI)染色法,原位末端标记法(TUNEL)和Caspase-3染色法标记毛细胞死亡模式,对比三种检测方法。结果PI染色法可将正常、凋亡、坏死和缺失的毛细胞区分开来,TUNEL法能初步鉴别毛细胞死亡模式,Caspase-3标记可定性凋亡和坏死的毛细胞。结论PI染色法快速、简便、可靠、经济,可用于定量检测凋亡和坏死的毛细胞。

耳蜗毛细胞凋亡早期的检测方法

目的:介绍一种耳蜗毛细胞凋亡早期的检测方法。方法:将豚鼠暴露于155dBSPL的脉冲噪声75次,于噪声暴露后5min解剖取耳蜗。采用异硫氰酸荧光素标记的鬼笔环肽(FITC-labeledphalloidin)进行毛细胞表皮板和纤毛肌动蛋白的染色,DNA荧光染料碘化丙锭(propidiumlodide, PI)进行细胞核染色,标记鉴别毛细胞死亡方式。原位末端标记法(TUNEL)进一步确认凋亡的毛细胞,荧光显微镜下观察凋亡的毛细胞形态学变化。结果:异硫氰酸荧光素标记的鬼笔环肽和PI双重染色发现毛细胞核发生轻微固缩时,其表皮板结构完好。TUNEL阳性标记物存在于固缩的细胞核内。结论:应用异硫氰酸荧光素标记的鬼笔环肽和PI双重染色法能够发现凋亡早期的毛细胞。

噪声暴露后耳蜗凋亡与坏死毛细胞琥珀酸脱氢酶活性的变化

目的揭示噪声暴露后耳蜗凋亡、坏死毛细胞线粒体功能的变化。方法将灰鼠暴露于155dBSPL的脉冲噪声75次,噪声暴露后5h解剖取双侧耳蜗。采用琥珀酸脱氢酶(Succinate Dehydrogenase,SDH)染色法进行耳蜗基底膜细胞线粒体染色,细胞核DNA荧光染料碘化丙啶(propidium iodide,PI)双重染色耳蜗基底膜,以未受噪声暴露动物为对照,显微镜下观察噪声暴露后耳蜗基底膜核固缩和核肿胀毛细胞琥珀酸脱氢酶染色的变化。结果噪声暴露损伤区的耳蜗外毛细胞SDH着色变浅,蓝色颗粒物存在于PI标记固缩的耳蜗毛细胞核周围,而肿胀的毛细胞核周围缺少SDH阳性染色物。结论强脉冲噪声暴露后,凋亡的耳蜗外毛细胞依然存在不同程度的线粒体功能,而坏死的外毛细胞线粒体功能受损严重。

线粒体能量转换功能在噪声诱导耳蜗毛细胞凋亡启动和进程中的作用

目的揭示线粒体能量转换功能在噪声性耳蜗毛细胞凋亡启动和进程中的作用。方法选择成年灰鼠17只,分为两组,实验组(12只)接受噪声暴露,对照组(5只)未接受噪声暴露。全部动物应用微量注射器将一种不可逆的琥珀酸脱氢酶(SDH)抑制剂3-硝基丙酸(3-NP,50mmol/L),滴入灰鼠右耳(实验耳)耳蜗圆窗膜,使其缓慢渗透到内耳以抑制细胞线粒体的能量转换功能。左耳(对照耳)耳蜗圆窗膜滴入人工外淋巴液(AP)。耳蜗圆窗膜给药后16h,将动物暴露于155dBSPL的脉冲噪声75次。噪声暴露后2h,解剖取双侧耳蜗。采用细胞核DNA荧光染料碘化丙锭(PI)染色耳蜗基底膜,荧光显微镜下观察噪声暴露后耳蜗基底膜毛细胞核的形态学变化。结果在噪声性耳蜗基底膜外毛细胞损伤区域内,实验耳可见大量中等程度核固缩、少量核碎裂的外毛细胞,而对照耳见大量核碎裂、少量中等程度核固缩的外毛细胞。结论线粒体能量转换功能在噪声诱导耳蜗毛细胞凋亡中起着重要的作用,抑制线粒体功能对强脉冲噪声诱导的耳蜗外毛细胞凋亡的启动无明显影响,但可延缓毛细胞凋亡的进程。

苯乙烯致耳蜗外毛细胞死亡的主要途径观察

目的通过比较凋亡坏死的细胞数量,揭示苯乙烯致大鼠耳蜗外毛细胞死亡的主要途径。方法成年Long Evens大鼠14只,随机分为实验组和对照组。实验组8只(16耳),胃饲苯乙烯400mg/kg(2g苯乙烯溶于1ml橄榄油),每日1次,每周5d,共3周。对照组6只(12耳),胃饲相同剂量的橄榄油,胃饲次数和时间与实验组相同。胃饲前及3周后应用电位反应测听仪检测短声诱发的动物双侧听性脑干反应阈值(ABR)。大鼠听觉功能检测后,断头处死,取出双耳听泡,固定耳蜗组织,分离耳蜗基底膜。分别用碘化丙锭(PI)和原位末端标记(TUNEL)染色细胞核,异硫氰酸荧光素标记的鬼笔环肽染色细胞的丝状肌动蛋白,鉴别凋亡、坏死和缺失的毛细胞,荧光显微镜下计数损伤(凋亡、坏死和缺失)的外毛细胞。结果对照组动物ABR阈值及耳蜗毛细胞形态未见异常改变。实验组大鼠胃饲苯乙烯3周后,短声诱发的平均ABR阈值(44.5±4.3dBSPL)较胃饲苯乙烯前(29.2±2.6dB SPL)提高约15dB SPL(P=0.001)。荧光显微镜下丝状肌动蛋白染色发现,实验组大鼠毛细胞主要损伤区域位于耳蜗中回,第三排外毛细胞损伤最为严重,其次为第二排、第一排外毛细胞。PI染色的外毛细胞核呈现核固缩、核肿胀和核缺失三种形态学变化,TUNEL强绿色荧光标记物存在于固缩的细胞核内。定量观察耳蜗外毛细胞死亡方式发现,固缩的外毛细胞核均数(42.2±40.4)为肿胀外毛细胞核(13.4±11.8)的3倍(P=0.01)。结论凋亡为胃饲苯乙烯3周后大鼠耳蜗外毛细胞死亡的主要途径。

老年Fischer 344大鼠耳蜗损伤外毛细胞的定量观察

目的通过定量观察老年Fischer344大鼠耳蜗损伤的外毛细胞,揭示年龄相关的大鼠耳蜗基底膜外毛细胞损伤的发展趋势和外毛细胞死亡的主要途径。方法 32只Fischer344大鼠分为两大组:青年组(13只,3～4月龄)和老年组(19只,20～27月龄),再将老年组大鼠进一步分为20～23月龄组(12只)和24～27月龄组(7只)。应用电位反应测听仪检测不同频率短纯音(5、10、20和40kHz)诱发的青年和老年大鼠双侧听性脑干诱发电位反应阈值(ABR)。听觉功能测试后,将动物断头,解剖取出双耳听泡,固定耳蜗组织,分离耳蜗基底膜。分别用细胞核DNA染料碘化丙锭(PI)和原位末端标记(TUNEL)染色不同月龄大鼠耳蜗基底膜细胞核,鉴别凋亡、坏死的毛细胞。异硫氰酸荧光素标记的鬼笔环肽对存在于毛细胞表皮板和纤毛的丝状肌动蛋白进行染色,确认缺失的耳蜗毛细胞。荧光显微镜下自耳蜗顶部到底部计数损伤(核缺失、核固缩和核肿胀)的外毛细胞,绘制耳蜗图。结果老年Fischer344大鼠的不同频率ABR阈值均高于青年组(P<0.05)。明显的TUNEL染色阳性反应不仅出现于不同程度固缩的外毛细胞核,而且见于细胞核型不变、PI染色略有加深的老年大鼠耳蜗外毛细胞核。定量观察发现,老年大鼠耳蜗外毛细胞损伤率(核缺失、核固缩和核肿胀)平均为32.75%±11.80%,其中24～27月龄组耳蜗外毛细胞损伤率(37.85%±9.00%)明显高于20～23月龄组(23.75%±7.65%,P=0.012)。与20～23月龄组大鼠比较,24～27月龄组耳蜗底回外毛细胞损伤增加率(32.20%±11.78%)明显高于顶回(12.80%±11.41%,P=0.022)。20～27月龄大鼠耳蜗基底膜核固缩外毛细胞数目(16.74±7.16)明显多于核肿胀外毛细胞(2.31±3.20,P=0.0001)。结论老年大鼠凋亡外毛细胞DNA特征性变化早于细胞核形态学的改变,耳蜗基底膜底回为老年耳蜗退行性变发展的主要部位,凋亡为老年大鼠耳蜗外毛细胞死亡的主要途径。

老年大鼠耳蜗毛细胞凋亡的信号通路

目的通过观察耳蜗基底膜毛细胞凋亡相关因子caspase-3、caspase-8和caspase-9表达的变化,揭示老年大鼠耳蜗毛细胞凋亡的信号通路。方法入选Fischer344大鼠27只,青年组12只,3～4月龄;老年组15只,20～27月龄。3种半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶荧光标记青年大鼠耳蜗各8个,老年大鼠耳蜗各10个。应用电位反应测听仪检测不同频率短纯音(5、10、20和40kHz)诱发的青年和老年大鼠双侧听性脑干诱发电位反应阈值(ABR)。听觉功能测试后,用微量注射器分别将新鲜配制的3种半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶荧光染色液缓慢注入动物内耳,耳蜗内灌注后1h,动物断头处死。采用细胞核DNA荧光染料碘化丙锭(PI)染色耳蜗基底膜细胞,荧光显微镜下观察不同月龄大鼠耳蜗基底膜毛细胞3种半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶荧光染色的变化。结果老年大鼠的不同频率听性脑干反应阈值均高于青年对照组(P<0.05)。青年大鼠耳蜗毛细胞核周围未见3种半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶阳性荧光标记物,老年大鼠耳蜗基底膜以核固缩为特征的凋亡外毛细胞核周围存在caspases-3和caspases-9绿色荧光标记物,未见caspases-8标记物。以核肿胀为特征的坏死外毛细胞核周围未见3种半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶阳性荧光标记物。结论老年大鼠耳蜗毛细胞凋亡可能通过caspases-9相关的线粒体信号转导通路而不是cas-pases-8相关的死亡受体通路启动完成。

人MCL1基因表达载体的构建及在293细胞中的表达

目的构建含有人髓细胞白血病基因-1(myeloid cell leukemia-1,MCL1)和绿色荧光蛋白基因(pEGFP)的真核共表达载体,为聋病的基因治疗奠定实验基础。方法应用基因重组技术和限制性内切酶酶切,及基因测序方法,构建并鉴定pEGFP-MCL1真核表达质粒。经脂质体介导转染293细胞系,荧光显微镜下观察pEGFP-MCL1真核表达质粒在293细胞系中的表达,利用逆转录-聚合酶链反应(Reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)检测MCL1mRNA的表达,Western Blot(蛋白质印迹)方法检测MCL1蛋白的表达。结果阳性重组子经酶切鉴定含有MCL1基因片段,基因测序结果与GenBank中MCL1序列相同。重组pEGFP-MCL1真核表达质粒转入293细胞系后24小时,荧光显微镜下可见绿色荧光表达,RT-PCR能够扩增出MCL1的条带,Western Blot检测出40kDa大小的蛋白。结论成功地构建了含有人全长MCL1基因和pEGFP基因的真核共表达载体,且能在哺乳动物293细胞系中表达。

N乙酰基-L-半胱氨酸对苯乙烯致耳蜗毛细胞损伤的防护作用

目的:观察N乙酰基-L-半胱氨酸(L-NAC)对苯乙烯致耳蜗毛细胞损伤的防护作用。方法:入选成年Long Evens大鼠17只,随机分为2组:胃饲苯乙烯的对照组8只和苯乙烯加L-NAC治疗的实验组9只。胃饲苯乙烯400mg/kg(2g苯乙烯溶于1ml橄榄油),每日1次,每周5d,共3周。胃饲苯乙烯后,实验组动物腹腔注射L-NAC(325mg/kg,生理盐水稀释),对照组腹腔注射等量生理盐水。胃饲苯乙烯、苯乙烯加L-NAC治疗前及3周后,应用电位反应测听仪检测短声诱发的动物双侧ABR阈值。大鼠听觉功能检测后,断头处死。3种荧光染料用于苯乙烯及苯乙烯加L-NAC治疗3周后的耳蜗基膜染色,DNA标记物PI、原位末端标记和异硫氰酸荧光素标记的鬼笔环肽染色分别用于观察毛细胞核和纤毛、表皮板形态学变化。荧光显微镜下自耳蜗顶回到底回依次计数损伤(核固缩、核肿胀和核缺失)的毛细胞。结果:实验组L-NAC治疗3周后,短声诱发的平均ABR阈移数值明显低于对照组(P<0.05)。荧光显微镜下定量观察发现,对照组外毛细胞核损伤(核固缩、核肿胀和核缺失)平均数目为28.3%,而实验组仅为10.6%(P<0.01)。实验组核固缩、核肿胀外毛细胞数目分别比对照组数目减少78%(P<0.01)和23%(P>0.05)。结论:本实验结果表明,L-NAC对苯乙烯致耳蜗毛细胞损伤具有较好的防护作用,其抗细胞凋亡作用更为明显。