转基因NOD小鼠胰腺Kuzbanian-DN mRNA的表达定位

目的检测Kuzbanian显性失活(Kuz-DN)基因mRNA在转基因非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠胰腺中的表达定位。方法转Kuz-DN基因的NOD小鼠8只,取胰腺,行冷冻与石蜡切片。用地高辛标记的Kuz-DN正义链及反义链cRNA探针,对组织切片进行原位杂交组织化学检测。结果在转基因阳性NOD小鼠胰腺组织中检测到强Kuz-DN mRNA信号。结论Kuz-DN mRNA在转基因动物模型定位、定性的实验结果,为Kuz基因改造后干预Notch/Delta信号传导途径,通过"旁侧抑制"影响细胞分化的基因治疗方案的研究提供了重要依据。

Kuzbanian基因非放射性原位杂交探针制备

目的研究制备地高辛(DIG)标记的Kuzbanian(KUZ)基因非放射性原位杂交探针,用于检测转基因动物、正常组织KUZ基因的表达。方法用体外转录法依自构建质粒pcDNA-KUZFL(质粒:6.0kb;探针:623bp)和pcDNA-KUZDN(质粒:5.8kb;探针:360bp)制备反义链与正义链DIG标记cRNA探针。结果用转基因模型阳性与阴性对照品系动物小鼠胰岛组织非放射性原位杂交实验,证实制备探针具有较高的特异性和敏感性。结论DIG标记KUZ基因杂交探针的成功制备,为进一步研究有关转基因动物的KUZ基因的分布和表达以及为正常组织KUZ基因的有关研究提供了实验基础。

人胰岛素基因逆转录病毒旋转感染Phoenix细胞的表达

目的:观察新构建人胰岛素基因逆转录病毒表达载体(pM54)在Phoenix和HepG2等细胞的表达情况。方法:1)脂质体法转染pM54质粒进入pT67、Phoenix和3T3细胞系;2)用新构建质粒的父本质粒p54和pCMVβGal质粒做转染基因对照;3)制备转染后细胞培养拟逆转录病毒上清液;4)旋转感染Phoenix及HepG2细胞;5)ELISA法检测转染、感染后上清液INS含量。结果:ELISA法检测证实感染细胞培养上清液中含较高水平目的蛋白INS的表达。对照结果均为阴性。结论:人胰岛素基因逆转录病毒介导旋转感染Phoenix等细胞,目的蛋白INS获得了预期的表达。实验为基因治疗或基因结合干细胞治疗糖尿病的进一步相关研究提供了重要数据。

STAT-3基因腺病毒介导感染ARIP、AR42J细胞的表达

目的:探测4种腺病毒液在胰腺源ARIP、AR42J细胞中的表达,为基因改造干预干细胞分化治疗糖尿病的进一步研究提供基础。方法:①扩增、纯化STAT-3 WT、STAT-3 DN、STAT-3 CA、STAT-3 GF 4种质粒;脂质体转染法转染质粒进入人胚肾293腺病毒包装细胞系,Hela细胞作为包装细胞的对照细胞。②生产含4种基因组合的腺病毒,腺病毒检测、鉴定。③常规与盖玻片法ARIP、AR42J等细胞培养;含目的基因的腺病毒液感染目标细胞。④荧光显微镜观察感染后细胞的基因表达。结果:STAT-3腺病毒基因载体生产了较高滴度(病毒滴度为6 X106pfu/ml)的腺病毒,用含目的基因的腺病毒对靶细胞感染3 d后,荧光显微镜观察到ARIP等细胞中绿色荧光蛋白成功、高效的阳性表达报告。结论:腺病毒介导STAT-3 WT、STAT-3 DN、STAT-3 CA、STAT-3 GF进入ARIP细胞的良好表达为STAT-3基因改造病毒感染干预干细胞分化的进一步相关研究提供了重要依据。

糖稳态调节细胞定向分化的基因改造方案探讨

目的:探索糖稳态调节细胞定向分化的基因改造方案思路。方法:①研究构建的解除干细胞分化抑制状态的信号传导与转录激活因子-3(STAT-3)基因载体,检测其介导目的基因感染AR IP等细胞基因表达;②研究构建的活化配体DL诱导N信号、在“旁侧抑制”过程中扮演重要角色的Kuzban ian(KUZ)基因载体在转基因小鼠表达后糖稳态调节细胞的分化。结果:在完成的STAT-3腺病毒基因载体生产了腺病毒,用带有目的基因的腺病毒对AR IP靶细胞进行感染,3 d后,荧光显微镜观察时,活细胞、固定液固定细胞均看到了构建基因中绿色荧光蛋白成功、高效的阳性表达报告。在完成的Kuzban ian(KUZ)基因载体构建、转基因、动物模型、小鼠品系鉴定后,用非放射性原位杂交实验对胰腺靶细胞的mRNA进行检测,获得了预期的阳性结果。结论:通过用某些分化抑制性基因的显性失活形式(DN)竞争性预先解除干细胞分化的抑制状态,然后再定向分化诱导使之朝向期望的目标细胞方向分化,可能是糖稳态细胞定向分化的可行途径之一。

LPKp-人胰岛素基因逆转录病毒载体的构建与鉴定

目的构建肝型丙酮酸激酶启动子(LPKp)与人胰岛素基因(hINSg)逆转录病毒表达载体并鉴定。方法1)母本pMDN-SIN及父本p54质粒扩增、纯化、酶切鉴定;2)取相关片段构建pM54载体并扩增、纯化、鉴定;3)脂质体法转染pM54进入pT67等细胞系,p54等质粒做对照基因;4)用转染后细胞上清液感染3T3细胞;5)ELISA法检测转染、感染后上清液INS含量鉴定质粒。结果酶切鉴定质粒大小与预期相符;ELISA法检测转染、感染上清液中均含较高水平INS。对照结果均阴性。结论LPKp-hINSg逆转录病毒表达载体pM54构建成功。实验为基因治疗或基因结合干细胞治疗糖尿病的进一步相关研究奠定了基础。

肝型丙酮酸激酶启动子与人胰岛素基因逆转录病毒介导感染pT67、HepG2细胞的蛋白质表达

目的检测新构建肝型丙酮酸激酶启动子(LPKp)与人胰岛素基因(hInsg)逆转录病毒表达载体(pM54,LPKp-hInsg)在pT67、HepG2细胞的表达情况,为基因治疗或基因结合干细胞治疗糖尿病寻找新的优化生物载体。方法 (1)限制酶切父、母本质粒p54、pMDN-SIN,取相关片段构建含人Ins基因-逆转录病毒载体pM54(pMDN-SINq-p54;LPKp-hInsg);pM54扩增、纯化、酶切鉴定;(2)脂质体FuGENE 6转染pM54质粒进入pT67、Phoenix E和3T3细胞系,同时转染pCMVβGal和父本质粒p54做对照;(3)制备转染后细胞培养拟逆转录病毒上清液;(4)用转染后细胞培养上清液旋转感染pT67、HepG2细胞;(5)ELISA法检测转染、感染后细胞培养上清液Ins含量。结果酶切鉴定质粒与构建预期相符;ELISA法检测出转染、感染上清液中均含较高水平Ins。对照结果均为阴性。结论 LPKp-hInsg基因逆转录病毒表达载体pM54构建成功。人胰岛素基因逆转录病毒介导旋转感染pT67等细胞,目的蛋白Ins获得了预期的表达。实验为基因治疗或基因结合干细胞治疗糖尿病的进一步相关研究奠定了基础。