pT67M54稳定单克隆细胞株（系）的建立

将一个拟定的目的重组基因构建转染进入一个具有优异品质的包装细胞，建立组合特定目的基因载体的独一无二的稳定单克隆细胞株(系)是一项极为艰苦、富有挑战而又非常重要的工作。根据研究的需要，我们选择和决定将经过一再测试已成功表达的新构建质粒pM54转染进入pT67细胞以建立能生产逆转录病毒(含特异启动子及目的基因)的稳定单克隆细胞株(系)。

人胰岛素基因逆转录病毒旋转感染Phoenix细胞的表达

目的:观察新构建人胰岛素基因逆转录病毒表达载体(pM54)在Phoenix和HepG2等细胞的表达情况。方法:1)脂质体法转染pM54质粒进入pT67、Phoenix和3T3细胞系;2)用新构建质粒的父本质粒p54和pCMVβGal质粒做转染基因对照;3)制备转染后细胞培养拟逆转录病毒上清液;4)旋转感染Phoenix及HepG2细胞;5)ELISA法检测转染、感染后上清液INS含量。结果:ELISA法检测证实感染细胞培养上清液中含较高水平目的蛋白INS的表达。对照结果均为阴性。结论:人胰岛素基因逆转录病毒介导旋转感染Phoenix等细胞,目的蛋白INS获得了预期的表达。实验为基因治疗或基因结合干细胞治疗糖尿病的进一步相关研究提供了重要数据。

逆转录病毒介导人胰岛素基因感染pT67、Phoenix和HepG2细胞的表达

十余年前，第一例腺苷酸脱氨酶缺陷症的基因矫正作用为多种疾病的基因治疗带来了极大希望和鼓舞。基因治疗是解决人类遗传缺陷症极有希望的途径。寻找可靠、高效、安全的载体仍是当前基因治疗的关键任务。本研究的目的在于探讨构建人胰岛素基因逆转录病毒载体并检测逆转录病毒介导人胰岛素基因感染pT67、Phoenix和HepG2细胞后胰岛素蛋白质的表达。

pT67M54细胞生产逆转录病毒旋转感染3们等4种细胞胰岛素的表达

用脂质体转染法转染我们自构建的含人胰岛素基因的逆转录病毒质粒pM54进入3T3源包装细胞pT67后，得到的能生产含人胰岛素基因的逆转录病毒的细胞，取名为pT67M54。转染时同时转染p54和pBGal进入pT67细胞作为质粒间对照。pM54、p54和pβGal三个质粒同时也转染入3T3和Phoenix两种细胞系作为细胞间对照。

LPKp-人胰岛素基因逆转录病毒载体的构建与鉴定

目的构建肝型丙酮酸激酶启动子(LPKp)与人胰岛素基因(hINSg)逆转录病毒表达载体并鉴定。方法1)母本pMDN-SIN及父本p54质粒扩增、纯化、酶切鉴定;2)取相关片段构建pM54载体并扩增、纯化、鉴定;3)脂质体法转染pM54进入pT67等细胞系,p54等质粒做对照基因;4)用转染后细胞上清液感染3T3细胞;5)ELISA法检测转染、感染后上清液INS含量鉴定质粒。结果酶切鉴定质粒大小与预期相符;ELISA法检测转染、感染上清液中均含较高水平INS。对照结果均阴性。结论LPKp-hINSg逆转录病毒表达载体pM54构建成功。实验为基因治疗或基因结合干细胞治疗糖尿病的进一步相关研究奠定了基础。

肝型丙酮酸激酶启动子与人胰岛素基因逆转录病毒介导感染pT67、HepG2细胞的蛋白质表达

目的检测新构建肝型丙酮酸激酶启动子(LPKp)与人胰岛素基因(hInsg)逆转录病毒表达载体(pM54,LPKp-hInsg)在pT67、HepG2细胞的表达情况,为基因治疗或基因结合干细胞治疗糖尿病寻找新的优化生物载体。方法 (1)限制酶切父、母本质粒p54、pMDN-SIN,取相关片段构建含人Ins基因-逆转录病毒载体pM54(pMDN-SINq-p54;LPKp-hInsg);pM54扩增、纯化、酶切鉴定;(2)脂质体FuGENE 6转染pM54质粒进入pT67、Phoenix E和3T3细胞系,同时转染pCMVβGal和父本质粒p54做对照;(3)制备转染后细胞培养拟逆转录病毒上清液;(4)用转染后细胞培养上清液旋转感染pT67、HepG2细胞;(5)ELISA法检测转染、感染后细胞培养上清液Ins含量。结果酶切鉴定质粒与构建预期相符;ELISA法检测出转染、感染上清液中均含较高水平Ins。对照结果均为阴性。结论 LPKp-hInsg基因逆转录病毒表达载体pM54构建成功。人胰岛素基因逆转录病毒介导旋转感染pT67等细胞,目的蛋白Ins获得了预期的表达。实验为基因治疗或基因结合干细胞治疗糖尿病的进一步相关研究奠定了基础。