RNA干扰技术抑制血管内皮生长因子表达

目的:应用RNA干扰技术抑制血管内皮生长因子(VEGF)表达。方法:将VEGF基因作为RNA干扰的靶区,通过E-RNAi网上提供的服务,设计两个特异的RNA干扰序列,将其装入含U6启动子的载体上,构建成抗VEGF基因的小发夹样RNA(shRNA)表达载体,再转染人胚肾细胞HEK293、结肠癌细胞HT29、宫颈癌细胞Hela和肝癌细胞HepG2,通过RT-PCR、Northern杂交和免疫荧光观察VEGF表达受抑的程度。结果:成功构建了两种抗VEGF基因的shRNA表达载体,RT-PCR发现其在HEK293和HT29细胞系中,能明显抑制VEGF基因的表达,抑制率分别为72%和42%,但在Hela和HepG2细胞中的抑制率仅为28%和13%;Northern杂交显示,在HEK293细胞和HT29细胞中,VEGFmRNA明显受抑,抑制率达88%和89%;免疫荧光显示,在HT29细胞中,VEGF蛋白表达的受抑制率为73%。结论:针对VEGF基因的shRNA表达载体能够明显抑制VEGF基因的表达,但在不同细胞系中的作用强度存在差别。

重组腺病毒介导外源性SOX9在正常关节软骨细胞中诱导软骨基质合成的体外表达

背景:关节软骨损害是临床一种常见的损伤,软骨形成转录因子SOX9是一种调控Ⅱ型胶原合成的关键因子。目的:观察以表达外源性SOX9的腺病毒体外成功感染关节软骨细胞后对Ⅱ型胶原和蛋白聚糖(Aggrecan)合成的影响,探讨软骨损伤后修复软骨缺损的基因治疗方法。方法:体外构建腺病毒载体AdSOX9和AdGFP,成功感染培养的人关节软骨细胞,分别以逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术检测了病毒感染前后SOX9、Ⅱ型胶原和蛋白聚糖基因mRNA的表达,同时以免疫组化技术检测了病毒感染前后关节软骨细胞中Ⅱ型胶原的表达。结果:应用AdEasy腺病毒构建专利技术体外成功构建了能高效表达外源性SOX9的腺病毒AdSOX9和只表达绿色荧光蛋白GFP的腺病毒AdGFP;以腺病毒AdSOX9和AdGFP体外成功感染人关节软骨细胞后48h,未感染对照组和AdGFP感染组,均检测到了Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的表达;而AdSOX9感染组的细胞中,检测到了SOX9基因mRNA的表达明显增高,与未感染对照组和AdGFP感染组相比有显著性差异(P<0.05),同时,Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的表达也较未感染对照组和AdGFP感染组明显增高,差异显著(P<0.05)。结论:以外源性SOX9为目的基因的腺病毒介导基因治疗方法,在促进关节软骨细胞Ⅱ型胶原和蛋白聚糖合成方面得出了初步满意的结果,SOX9可能是关节软骨缺损基因治疗研究领域一个新的理想靶点,值得继续深入研究。

Faciogenital dysplasia 6基因对肝干细胞分化的调控作用

目的探讨FGD6（faciogenital dysplasia）基因对肝干细胞分化调控的作用。方法选取FGD6基因干扰靶序列，使用AdEasy系统构建腺病毒载体，包装并扩增重组腺病毒载体psEs-FGD6-siRNA，感染HP14．5细胞。细胞免疫荧光检测FGD6蛋白在HP14．5细胞中的表达水平，实时荧光定量PCR检测FGD6、甲胎蛋白（AFP）及白蛋白（Alb）的mRNA水平，Westernblot检测FGD6、AFP及Alb的蛋白表达水平。每组细胞均设置pSES-Ad-RFP腺病毒空载体感染进行对照。所有数据用均数±标准差（x-±s）表示，采用单因素方差分析。结果FGD6蛋白主要表达于HP14.5细胞胞核中。成功构建腺病毒载体pSES-FGD6-siRNA。下调FGD6基因在HP14．5细胞中的表达，可降低AFP的mRNA及蛋白的表达，而升高Alb的mRNA及蛋白的表达（P〈0．01）。结论抑制FGD6基因在HP14．5细胞中的表达，可使HP14．5细胞向肝细胞方向分化，因此，FGD6基因对肝干细胞分化调控可能起着重要作用。

过表达FGD6对肝干细胞分化的调控作用

该文主要探讨过表达FGD6(faciogenital dysplasia 6)基因对肝干细胞分化的调控作用及其可能的机制。将FGD6基因插入腺病毒载体使其过表达,并包装成腺病毒(Ad-FGD6),感染小鼠胚胎肝干细胞HP14.5,以空载体腺病毒(Ad-null组)和未感染腺病毒组(Blank control组)作为对照;半定量PCR和Western blot分别检测FGD6、肝干细胞标志物(AFP)、肝细胞标志物(ALB)、胆管上皮细胞标志物(CK19、SOX9)及Wnt经典通路中的标志物(β-catenin、wnt3a)的m RNA和蛋白表达水平;并通过糖原染色法(PAS染色)检测细胞内糖原合成的变化情况;CCK8检测各组细胞增殖情况。结果显示,感染Ad-FGD6腺病毒后,与Ad-null组及Blank control组相比,HP14.5细胞中的FGD6的m RNA和蛋白表达水平升高(P<0.05),肝干细胞标志物(AFP)及胆管上皮标志物(CK19、SOX9)的m RNA及蛋白的表达水平降低(P<0.05),而肝细胞标志物ALB及Wnt经典通路中的标志物(β-catenin、wnt3a)的m RNA和蛋白的表达水平均升高(P<0.05);PAS染色发现,Ad-FGD6组存在紫红色颗粒,呈阳性反应,这说明有糖原合成。CCK8检测发现,Ad-FGD6组能促进肝干细胞增殖(P<0.05)。因此,过表达HP14.5细胞的FGD6会使HP14.5细胞向肝细胞分化并促进细胞增殖,而这一过程可能通过Wnt经典信号通路实现。