新型乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白核酸疫苗的免疫原性研究

目的 观察新型乙型肝炎病毒 (HBV)表面抗原中蛋白 (MHBs)核酸疫苗的免疫原性。方法 以新型人体应用载体质粒pSW 3891构建MHBs核酸疫苗 (pSW3891 /MHBs/adr) ,对照组和实验组Balb/c小鼠分别基因枪法免疫对照载体质粒 (pSW 3891 )和MHBs核酸疫苗 ,采用酶联免疫吸附试验检测抗HBs ,LDH释放测定法检测小鼠特异性细胞毒T淋巴细胞 (CTL)杀伤活性。结果 MHBs核酸疫苗可在体外高效表达 ,免疫小鼠后可产生高滴度抗HBs,血清阳性终点滴度达 1∶972 0 0 ,小鼠脾细胞HBs特异性细胞毒性T淋巴细胞 (CTL)杀伤活性达 78 81 %。

乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白去糖基化对体液免疫应答的影响

目的:观察乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原中蛋白(MHBs)中去糖基化对体液免疫应答的影响。方法:在MHBs核酸疫苗(pSW3891/MHBs/adr)基础上,通过PCR扩增基因修饰法,使MHBs上编码第4、59、146位氨基酸密码子基因由AAT/AAC突变为CAG,从而使AAT/AAC编码的天冬酰胺Asn(N)突变为CAG编码的谷氨酰胺Gln(Q),使得N-糖基化位点NXS、NXT突变为QXS、QXT。构建3株去糖基化核酸疫苗(dG1,去除Asn4处糖基化位点,位于preS2上;dG23,去除Asn59、Asn146处糖基化位点,均位于HBs上;dG123,去除Asn4、Asn59及Asn146位糖基化位点)。脂质体法转染293T细胞,Western blot检测,观察它们在293T细胞中瞬时表达的差异;肌肉注射法免疫BALB/c小鼠,观察MHBs去糖基化对小鼠体液免疫应答的影响。结果:adr、dG23转染293T细胞后,在细胞内及上清液中均检测到HBsAg;dG1、dG123转染293T细胞后,在细胞内检测到HBsAg,但是上清液中未测到。adr、dG1及dG23免疫BALB/c小鼠后均产生抗-HBs抗体,最高滴度均达到1:102 400;dG123几乎无抗体反应(<1∶200)。结论:Asn4去糖基化导致MHBs向细胞外的分泌障碍,但是对小鼠抗-HBs的产生无影响。Asn59、Asn146两处同时去糖基化对MHBs的分泌和小鼠抗-HBs的产生影响轻微。Asn4、Asn59及Asn 146三处同时去糖基化明显影响MHBs的分泌和小鼠抗-HBs的产生。

新型乙肝表面抗原中蛋白核酸疫苗在中国猕猴体内免疫原性初步研究

目的:观察乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白(MHBs)核酸疫苗在中国猕猴体内的体液和细胞免疫应答。方法:实验用中国猕猴实验组、对照组各2只,分别在第0、8、16、24、48周肌肉注射法接种核酸疫苗(pSW3891/MHBs)或对照载体(pSW3891)。ELISA法检测中国猕猴血清抗-HBs,CFSE-PI染色FCM(流式细胞术)法测定中国猕猴外周血淋巴细胞HBsAg特异性增殖反应。结果:实验组中国猕猴血清抗-HBs滴度在72周达到最高峰,最高滴度分别为1∶6400和1∶12800,对照组抗-HBs滴度始终保持在1∶50。实验组中国猕猴外周血淋巴细胞HBsAg特异性增殖反应明显增强,细胞分裂指数分别为18.64和14.70,而对照组细胞分裂指数分别为1.62和2.61。结论:建立了CFSE-PI染色流式细胞仪检测法来检测中国猕猴外周血淋巴细胞HBsAg抗原特异性增殖反应,方法创新,实用可靠。新型乙肝表面抗原中蛋白核酸疫苗pSW3891/MHBs在中国猕猴体内能产生良好的特异性体液和细胞免疫应答。

密码子优化的中国HIV-1流行亚型gp120共识序列核酸疫苗的构建及其免疫原性的初步研究

目的:构建能表达密码子优化的中国HIV-1流行亚型AE、BC和B’gp120共识序列的核酸疫苗,并研究其免疫原性。方法:根据HIV-1的分子流行病学资料和包膜糖蛋白的氨基酸序列分析,设计了针对中国流行的AE,BC和B’(ThB)亚型的gp120共识序列。按哺乳动物细胞偏好的密码子对AE,BC和ThB3个亚型的gp120共识序列分别进行密码子优化,合成优化基因。将密码子优化的gp120基因克隆到核酸疫苗载体pSW3891,构建重组质粒核酸疫苗。将重组质粒转染293T细胞,并以重组质粒疫苗免疫新西兰兔。应用蛋白质免疫印迹法检测转染细胞中gp120蛋白的表达。ELISA方法检测免疫后兔血清中gp120特异性抗体的产生。结果:3个密码子优化的gp120核酸疫苗,均能正确表达gp120。这些gp120核酸疫苗免疫家兔后,能产生HIV-1包膜糖蛋白特异性的抗体。结论:成功构建3个密码子优化的、表达HIV-1中国流行亚型AE,BC和ThB的共识序列的gp120核酸疫苗,能诱导HIV-1包膜蛋白特异的免疫反应。

新型乙型肝炎病毒核心区核酸疫苗的免疫原性研究

目的 观察新型乙型肝炎病毒(HBV)核心抗原(HBcAg)核酸疫苗的免疫原性。方法 应用新型人体应用载体质粒pSW3891构建HBcAg核酸疫苗(pSW3891/HBC),对照组和实验组Balb/c小鼠分别以基因枪法免疫对照载体质粒(pSW3891)和HBcAg核酸疫苗,采用酶联免疫吸附试验检测抗-HBc,乳酸脱氢酶(LDH)释放测定法检测小鼠HBcAg特异性CTL杀伤活性。结果 HBcAg核酸疫苗可在体外293T细胞中高效表达,免疫小鼠后可产生高滴度抗-HBc(1:97200),免疫鼠脾细胞HBc特异性CTL杀伤活性达73.25％。结论 新型HBcAg核酸疫苗在Balb/c小鼠实验中表现出良好的体液和细胞免疫原性。

DNA疫苗预敏蛋白疫苗增强策略对乙型肝炎病毒表面抗原蛋白免疫应答的影响

目的:观察核酸疫苗预敏,乙型肝炎病毒HBsAg蛋白疫苗增强的免疫对Balb/c小鼠免疫应答的影响。方法:以Transfection TM脂质体将乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白(MHBs)核酸疫苗pSW3891/MHBs/ad(r简称为adr),及空载体pSW3891(简称vector)体外转染293T细胞。免疫印迹法(Westernblot)检测adr,vector的体外表达;动物体内研究选用Balb/c小鼠共18只,每组6只,编号后随机分为3组,即空载体质粒组(vector+vector组)、adr核酸疫苗+HBsAg蛋白疫苗(adr+protein组)、HBsAg蛋白疫苗+HBsAg蛋白疫苗(Protein+Protein组);于第0周肌肉注射法分别以vector、adr及HBsAg蛋白疫苗免疫小鼠,于第4周肌内注射法分别以vector、HBsAg蛋白疫苗、及HBsAg蛋白疫苗免疫小鼠。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测小鼠血清HBsAg特异性抗体、酶联免疫斑点(ELISPOT)法检测小鼠脾细胞HBsAg多肽特异性IFN-γ分泌细胞。结果:adr体外转染293T细胞后,能够表达乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白(MHBs);体内研究结果显示:除vector+vector组外,adr+protein组、Protein+Protein组小鼠均能检出血清抗-HBs,Protein+Protein组抗-HBs终点滴度比adr+protein组高,但无统计学意义;三组中vector+vector组没有检测到特异性INF-γ分泌的脾细胞,而adr+protein组、Protein+Protein组小鼠均能检出,且adr+protein组特异性细胞数量显著高于protein+protein组(P<0.001),具有统计学意义。结论:乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白(MHBs)核酸疫苗预敏,能明显增强Balb/c小鼠对乙型肝炎HBsAg蛋白疫苗细胞免疫应答水平。

N-糖基化移位对乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白核酸疫苗的表达及免疫原性的影响

目的:研究N-糖基化移位对乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白核酸疫苗体外蛋白表达及小鼠体内体液免疫及细胞免疫应答的影响。方法:通过基因工程中定点突变技术,将乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白(MHBs)中第4位氨基酸上连接的糖链去除,或将糖链依次移位至第5、6或7位氨基酸,来构建N-糖基化去除及移位的核酸疫苗,分别命名为Adr-dN4、Adr-N4-5、Adr-N4-6、Adr-N4-7。用上述核酸疫苗与野生型MHBs核酸疫苗(pSW3891/MHBs/Adr,简称Adr)及空载体质粒pSW3891分别用脂质体瞬时转染293T细胞,应用蛋白印迹法检测MHBs的表达。采用肌肉注射法,以各组疫苗分别对BALB/c小鼠于第0、2、4和6周进行免疫,用ELISA法检测小鼠血清中抗-HBs抗体、ELISPOT法检测小鼠表面抗原多肽特异性分泌IFN-γ的脾细胞数量。结果:蛋白印迹法结果显示Adr、Adr-dN4、Adr-N4-5、Adr-N4-6、Adr-N4-7体外转染293T细胞后,均可以在293T细胞内表达,且Adr、Adr-N4-5、Adr-N4-7可将表达产物分泌到细胞外。ELISA及EISPOT结果表明:Adr免疫组小鼠抗-HBs终点滴度及表面抗原特异性分泌IFN-γ的脾细胞数量,均略高于其他免疫组小鼠,但与Adr-N4-5、Adr-N4-7相比无统计学差异(P>0.05),与Adr-dN4和Adr-N4-6组相比有显著的统计学差异(P<0.05)。结论:在第5或7位氨基酸附加N-连接糖链,能修补或替代Asn4连接糖链引导MHBs分泌的功能。HBs表达蛋白分泌到细胞外对诱导机体产生特异性细胞和体液免疫是至关重要的。

外分泌型的乙型肝炎病毒核心抗原核酸疫苗的构建与体外表达

目的:构建含有组织型纤溶酶原激活剂(tPA)信号肽的乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)核酸疫苗。方法将HBcAg基因用PCR方法扩增并分别引入相应的限制性内切酶酶切位点,然后克隆入pJW4303载体中获得相应的核酸疫苗,经筛选鉴定后,用上述核酸疫苗与野生型HBcAg核酸疫苗及空载体质粒pJW4303分别用脂质体瞬时转染293T细胞,应用蛋白印迹法检测核心抗原的表达。结果成功构建以pJW4303为载体的含tPA信号肽的HBcAg核酸疫苗,体外表达证实含tPA信号肽的HBcAg在293T细胞胞内和胞外均能表达,含tPA信号肽的HBcAg核酸疫苗的核心抗原表达水平较高。结论以pJW4303为载体的含tPA信号肽的HBcAg核酸疫苗能够将细胞内的HBcAg分泌到细胞外,为进一步研究其免疫原性打下了基础。