多巴胺D1受体调控大脑神经前体细胞增殖的机制

目的:哺乳动物脑皮质中的多数神经细胞都产生于大脑发生期短暂存在的皮质增殖区,位于增殖区的细胞高水平表达多巴胺D1受体,实验探讨D1受体的相关功能作用。方法:实验于2002-06/2003-09在美国马里兰州立大学生物医学系完成。①选取孕14d的CD1雌鼠8只,麻醉后解剖取出胎鼠大脑,以含20mg/L表皮生长因子的无血清培养液培养脑皮质区的细胞作为实验模型。②细胞培养96h后,离心粉碎。取40μg样本于梯度SDS凝胶电泳,分离开的蛋白转移到纤维素膜,封闭后与细胞表型特异抗原(β-Ⅲtubulin,Vimentin,Nestin)或多巴胺D1A或D1B的抗体4℃反应过夜,进行WesternBlot检测。③细胞培养72h后,加入0,6.4,12.5,25,50,75,100μmol/L多巴胺D1受体激动剂SKF38393和25g/LBrdU处理6h,与FITC-标记的抗BrdU抗体4℃反应过夜,固定后加入5mg/LPI和1g/LRnase,检测BrdU摄入情况。④在确定细胞周期基础特征的试验中,培养细胞不做药物处理,于培养后8,21,34,48,72,96h分别采集。在监测多巴胺D1受体激动剂SKF38393对细胞周期影响的试验中,0～100μmol/LSKF38393在培养后48h被加入到培养皿中,孵育至96h。在SKF38393的药理特异性试验中,同时加入75μmol/LSKF38393和10μmol/LD1受体特异性拮抗剂SCH23390或NNC010756连续孵育48h。离心固定后加入5mg/LPI和1g/LRNase。PI染色细胞可以显示分布于G0-1,S,G2-M期以及细胞凋亡情况。结果:①细胞表面不同抗原亚型的定量分布和动态变化:约60%细胞vimentin染色阳性,β-Ⅲtubulin染色阳性细胞占35%,nestin染色阳性细胞占25%。Westernblot蛋白定量分析结果显示,vimentin和nestin的表达呈增加趋势,且nestin尤为明显,相反β-Ⅲtubulin的表达呈降低趋势。②细胞多巴胺D1受体表达的定量分析和动态变化:(95±4)%的细胞D1A受体表达阳性,(94±6)%的细胞D1B受体表达阳性。D1A、D1B受体在任何一个抗原亚型的细胞群中均有高比例表达。③多巴胺D1受体抑制表皮生长因子依赖性神经干细胞的BrdU摄入:0,6.4,12.5,25,50,75,100μmol/LSKF38393呈浓度依赖性的抑制表皮生长因子支持的大脑前体细胞对BrdU的摄入比例,50μmol/L时产生显著性差异(P<0.05),细胞对BrdU的摄入比例降低至17%左右。④多巴胺D1受体抑制表皮生长因子依赖性神经干细胞的周期进展:SKF38393可以浓度依赖性地增加表皮生长因子支持的神经干细胞G0-1/S比值,无药物时G0-1/S值为3,加入SKF38393后升高至14(P<0.05);当同时加入SKF38393和D1受体特异性拮抗剂SCH23390或NNC010756后,SKF38393对G0-1/S的升高作用被阻断,G0-1/S降低至无药物水平3(P<0.05)。此外SKF38393并不增加相应培养细胞中的凋亡细胞数。结论:多巴胺D1受体能够抑制表皮生长因子支持的神经干细胞增殖,主要是通过可逆性地受体特异性的抑制G1期的细胞进入S期,同时并不引起细胞凋亡的增加及分化来实现的。