GJB6基因敲除小鼠耳蜗血管纹超微结构观察

目的观察缝隙连接蛋白30（connexin，Cx30）基因敲除纯合子Cx30（-/-）小鼠（P3、P7、P10、P30、P60、P90）耳蜗血管纹（stria vascularis，SV）超微结构的发育情况，进一步探讨GJB6基因突变导致耳聋的机制。方法选取Cx30（-/-）小鼠P3、P7、P10、P30、P60、P90等6个发育阶段的小鼠，用透射电镜观察耳蜗血管纹超微结构变化情况。结果P3～P90耳蜗血管纹边缘细胞、中间细胞、基底细胞呈现一个由不成熟至成熟的正常发育过程，至P90时均未发现退化性表现或缺失改变。血管纹毛细血管随着小鼠日龄的增加，管腔逐渐变宽，逐渐成熟，高倍镜下见P3、P7、P10时血管内皮细胞结构无明显异常，P30时内皮细胞之间的纤维突起出现疏松，P60时内皮细胞之间出现较大的裂隙，P90时这种改变更加严重，内皮细胞之间出现扩大的细胞间隙。结论 GJB6基因缺陷本身并不影响耳蜗组织血管纹的形态发育和成熟，GJB6缺失引起小鼠出生后逐渐出现的血管纹内皮细胞超微结构的改变导致内皮细胞屏障破坏，可能引起耳蜗内电位缺失，从而造成听力的下降。

连接蛋白29在小鼠耳蜗中的表达

目的研究连接蛋白29(connexin 29,Cx29)在小鼠内耳的表达,探讨Cx29突变致聋的原因。方法野生型小鼠耳蜗冰冻切片,用神经丝蛋白(neurofilament,NF)、髓鞘相关糖蛋白抗体(myelin associated glycoprotein,MAG)和神经胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)抗体与Cx29抗体行双重免疫荧光染色,荧光显微镜观察染色结果。结果Cx29主要表达于位听神经和螺旋神经节细胞髓鞘,MAG与Cx29的共同表达于内耳位听神经处,表达呈圈状;GFAP只在内听道以外的脑干部位表达,与Cx29无共同表达;Cx29形成一个个圈样围绕NF;血管纹处可见Cx29微量表达。结论Cx29在小鼠内耳中大量表达,可能对维持小鼠正常听觉功能起重要作用。

蛋氨酸对化疗药物引起内耳损伤的保护作用

目的研究蛋氨酸对化疗药物顺铂导致耳毒性的保护作用。方法将30只昆明小鼠随机分为3组。顺铂组(n=10):给予顺铂3.5mg·kg^(-1)·d^(-1)腹腔注射,连续7d;蛋氨酸+顺铂组(n=10):蛋氨酸300mg·kg^(-1)·d^(-1)腹腔注射,30min后给予顺铂3.5mg·kg^(-1)·d^(-1)腹腔注射,连续7d;对照组(n=10):生理盐水3.5mg·kg^(-1)·d^(-1)腹腔注射,连续7d。实验第8天,利用听觉脑干诱发电位(auditory brainstem response,ABR)对3组小鼠进行听功能测试,然后迅速断头取出双侧内耳,解剖耳蜗基底膜,铺片并HE染色,普通光学显微镜下观察。结果在ABR测试中,对照组小鼠实验前后听力无明显变化;顺铂组小鼠听阈及Ⅰ波和Ⅲ波潜伏期与对照组相比变化明显;蛋氨酸+顺铂组小鼠听阈及Ⅰ波和Ⅲ波潜伏期与对照组相比也出现变化,但变化程度较顺铂组明显减轻。光镜观察:对照组动物耳蜗基底膜外毛细胞排列整齐;顺铂组基底膜外毛细胞有不同程度的坏死、脱落,尤以底转缺失严重;蛋氨酸+顺铂组耳蜗毛细胞损伤较顺铂组明显减轻。结论化疗药物顺铂对耳蜗毛细胞引起损害,而蛋氨酸对这种损害有较好的保护作用。

人GJB2基因错义突变表达载体构建及鉴定

目的构建6种分别携带GJB2基因错义突变A40G、V37I、L90P、L90V、V84L和W44C的真核表达载体,转染HEK293细胞,建立6种错义突变的稳定表达细胞系。方法以野生型Cx26-EGFP融合蛋白质粒为模板,用Stratagene公司定点突变试剂盒构建错义突变表达载体,直接测序鉴定序列正确性,选取含有突变的载体转染HEK293细胞,G418选择性培养2周,流式细胞仪筛选表达阳性细胞,扩增培养形成稳定表达人Cx26突变的HEK293细胞系。培养细胞用4%多聚甲醛固定,鬼笔环肽和4',6-二脒基-2-苯基吲哚衬染细胞核,荧光显微镜下检测结果。结果6种突变表达载体经过测序,均含有相应突变,无多余突变出现,转染后均可在细胞间形成缝隙连接,呈现绿色荧光。结论成功构建6种携带GJB2基因错义突变的真核表达载体,为进一步研究错义突变致聋原因奠定了实验基础。

腺相关病毒在不同年龄小鼠耳蜗中表达的研究

目的观察腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)血清型9(AAV9)在不同年龄小鼠耳蜗中的感染和表达情况.方法将携带绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的AAV9通过圆窗注射或中阶注射两种途径分别导入不同年龄组小鼠的内耳,根据年龄和注射部位分为4组(每组6只):P1SM组,出生后1天(P1)小鼠经中阶注射;P1RW组,出生后1天(P1)小鼠经圆窗注射;P9RW组:出生后9天(P9)小鼠经圆窗注射;P30RW组,成年小鼠(P30)经圆窗注射.4组小鼠注射后1个月行听性脑干反应(auditory brainstem response,ABR)测试以及耳蜗基底膜铺片观察GFP在内耳中的表达情况(所有小鼠均左耳手术注射AAV9,右耳做为空白自身对照).采用GraphPad Prism 5统计软件进行数据分析.结果GFP可特异性表达于耳蜗毛细胞,新生小鼠(P1)两种注射途径均可导致GFP在内、外毛细胞高表达,且注射耳ABR反应阈值与对侧非注射耳相比,差异无统计学意义(P值均>0.05).P9RW组小鼠耳蜗内毛细胞GFP表达均为阳性,而外毛细胞表达明显下降;P30RW组仅内毛细胞GFP表达阳性,其外毛细胞无阳性表达.P9RW组与P30RW组注射耳ABR反应阈值较对侧耳均明显提高,差异有统计学意义(P值均<0.01).结论AAV9转染新生小鼠后可在耳蜗内、外毛细胞中高表达,且对小鼠ABR反应阈无明显影响;成年小鼠内耳转染AAV9后,仅在内毛细胞表达,并造成小鼠ABR反应阈升高.AAV9在新生小鼠耳蜗中的转染效率明显高于成年小鼠.