白藜芦醇对乳房链球菌感染引起乳腺细胞氧化应激的影响及机制

[目的]本试验旨在探讨白藜芦醇对乳房链球菌(Streptococcus uberis)感染引起乳腺细胞氧化应激的影响及机制。[方法]先用15μmol·L^-1白藜芦醇(resveratrol)处理小鼠乳腺上皮细胞(EpH4-Ev)4 h,再加入乳房链球菌(MOI=10)共孵育3 h,收集样品;通过生化试剂盒(硝酸还原酶法、比色法、微量法等)、流式细胞术、显微镜观察、Western blot、RT-qPCR等方法检测相关指标的变化。[结果]乳房链球菌(S.uberis)感染可显著提高EpH4-Ev细胞活性氧(ROS)水平和一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)含量以及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、乳酸脱氢酶(LDH)、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase)、超氧化物歧化酶(SOD)活性,降低总抗氧化能力(T-AOC)水平。白藜芦醇预处理后可显著降低ROS水平、NO含量以及iNOS、LDH、NAGase活性,显著提高T-AOC水平,进一步提高SOD活性。在分子水平上,S.uberis感染显著提高EpH4-Ev细胞血红素加氧酶1(HO-1)、NAD(P)H:醌氧化还原酶1(NQO1)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)mRNA与核因子E2相关因子2(Nrf2)蛋白的表达水平,而白藜芦醇预处理对此有进一步提升作用。显微镜下观察发现白藜芦醇预处理可以明显改善由S.uberis感染引起的小鼠乳腺上皮细胞皱缩。[结论]白藜芦醇可以有效缓解乳房链球菌感染引起乳腺细胞的氧化应激,这可能与白藜芦醇激活Nrf2蛋白并促进其下游抗氧化基因表达相关。

牛磺酸对乳房链球菌感染引起的氧化应激影响及其机制

[目的]本文旨在探究牛磺酸对乳房链球菌(Streptococcus uberis)感染引起的氧化应激反应的影响及机制。[方法]用70 mmol·L^(-1)牛磺酸(taurine)处理牛乳腺上皮细胞(MAC-T)4 h,加入S.uberis[感染复数(MOI)=10]继续培养3 h,收集细胞;用靶向siRNA干扰牛磺酸的2个转运载体(TauT、PAT1)的表达,再用70 mmol·L^(-1)牛磺酸处理4 h,收集样品。通过Western blot、流式细胞术、试剂盒(ABTS法、TBA法、WST-1法、钼酸铵法等)、免疫荧光等方法,检测Keap1和Nrf2蛋白的表达,活性氧(ROS)和细胞内总抗氧化能力(T-AOC)水平,丙二醛(MDA)含量,超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性及Nrf2蛋白在细胞中的定位。[结果]S.uberis感染能够显著降低T-AOC水平及提高MDA和ROS含量,使SOD和CAT活性显著提高(P<0.05)。与S.uberis感染组相比,牛磺酸预处理后感染细菌显著提高胞内T-AOC水平及SOD和CAT活性,降低MDA和ROS含量,并抑制Keap1的表达,促进Nrf2的表达及入核(P<0.05);抑制牛磺酸转运载体TauT、PAT1的表达后,Keap1的降低及Nrf2的升高被显著抑制(P<0.05)。[结论]牛磺酸可能通过转运载体TauT、PAT1进入乳腺上皮细胞,并通过激活Keap1-Nrf2信号通路缓解S.uberis感染引起的氧化应激反应。

氧化型辅酶NAD^+及布氏杆菌SahH活性位点对SahH催化活性的影响

[目的]本文旨在鉴定影响布氏杆菌S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(S-adenosylhomocysteine hydrolase,SahH)催化S-腺苷同型半胱氨酸(S-adenosylhomocysteine,SAH)产生同型半胱氨酸(homocysteine,HCY)的催化活性位点。[方法]将表达载体pET28a-Bru-sahH转化大肠杆菌BL21中,表达、纯化布氏杆菌SahH(Bru-SahH)蛋白,分析辅酶NAD+、磷酸化修饰及活性位点对Bru-SahH催化活性的影响。[结果]添加NAD+后,Bru-SahH的催化活性降低85.6%;对Bru-SahH质谱分析表明,其444位丝氨酸为可能的磷酸化位点,对该位点突变后Bru-SahH催化SAH形成HCY的活性降低85.5%;生物信息学分析表明,Bru-SahH的337位和338位氨基酸为其活性位点,分别对上述2个位点进行单突变和双突变,突变后的Bru-SahH催化活性降低90.8%以上。[结论]Bru-SahH的337、338和444位氨基酸是其催化活性位点,添加外源性NAD+可抑制其催化活性。