尼古丁对BV-2小胶质细胞α7烟碱型乙酰胆碱受体、小胶质细胞P2X4受体表达和脑源性神经营养因子释放的影响

目的观察尼古丁对BV-2小胶质α7烟碱型乙酰胆碱受体（α7nicotine acetyleholine receptor，α7nAChR）、小胶质细胞P2X4受体（P2X4receptor，P2X4R）表达和脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor,BDNF）释放的影响，以探讨小胶质细胞参与尼古丁所致痛觉过敏的可能分子机制。方法①BV-2小胶质细胞接种在含12mm圆形盖玻片无菌12孔板，待细胞处于对数生长期，完全随机分为2组：α7nAChR组和P2X4R组。免疫荧光标记检测α7nAChR和P2X4R在BV-2小胶质细胞上的表达。②当12孔板中BV-2细胞处于对数生长期，完全随机分为4组：尼古丁实验组（N组），尼古丁终浓度为100μm／L；无血清培养基培养的空白对照组（C组）；尼古丁拮抗剂组（NM组），10nmol／L甲基牛扁碱（methyllycaconitine，MLA）预孵育30min，改用含尼古丁的无血清培养基培养；单纯拮抗剂组（M组），10nmol／LMLA预孵育30min，改用无血清培养基培养。培养72h后收集各组细胞。应用实时荧光定量PCR（real-timequantitativePCR，RT-qPCR）检测α7nAChRmRNA和P2X4RmRNA表达量的变化，Westernblot检测α7nAChR和P2X4R蛋白表达量的变化。③当12孔板中细胞处于对数生长期，完全随机分为4组：正常对照组（Control组）、尼古丁预处理＋DMEM组（Nicotine＋DMEM组）、尼古丁预处理＋激动剂组（Nieotine＋ATP组），尼古丁预处理＋拮抗剂组（Nicotine＋5-BDBD组）。其中激动剂和拮抗剂由DMEM无血清培养基稀释，在尼古丁处理72h后加入，各组总体积保持一致，24h后ELISA检测培养液中BDNF释放量。结果①免疫荧光标记结果显示BV-2细胞存在α7nAChR和P2X4R的阳性表达。②RT-qPCR结果显示尼古丁可上调BV-2细胞α7nAChRmRNA和P2X4RmRNA的表达，α7nAChR特异性拮抗剂MLA可抑制α7nAChRmRNA和P2X4RmRNA表达的上调；Westernblot结果显示尼古丁处理可使BV-2细胞α7nAChR和P2X4R蛋白的表达上调，α7nAChR特异性拮抗剂MLA可抑制α7nAChR和P2X4R蛋白表达的上调。③ELISA检测培养液中BDNF含量结果显示：Nieofine＋ATP组较Nieofine＋DMEM组和Control组显著增多（P〈0．05），Nicotine＋DMEM组较Control组增多（P〈0．05）；Nicotine＋5-BDBD组较Nicotine＋DMEM组和Control组显著减少（P〈0．05）.结论尼古丁可能通过α7nAChR上调小胶质细胞上P2X4R的表达进而通过BDNF的释放引起痛觉过敏的产生。