亚致死热损伤对肺癌A549细胞转录组的影响

目的通过测序技术探索受到亚致死热损伤刺激的肺癌A549细胞转录组随时间的动态变化,以及亚致死热损伤影响肺癌生物学功能的初步机制。方法体外使用亚致死温度刺激肺癌A549细胞,通过Transwell实验检测受刺激后不同时间点(24、48和72h)细胞的侵袭和迁移能力;蛋白质印迹法检测基质金属蛋白酶2(MMP-2)和MMP-9蛋白水平在不同时间点(12、24、48和72h)的表达变化。转录组测序筛选出差异表达基因(DEGs)并通过实时荧光定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)进行验证,通过基因本体论(GO)富集分析、基因组百科全书(KEGG)功能分析和聚类分析探索潜在的机制。结果肺癌A549细胞受亚致死热损伤刺激后,侵袭和迁移能力出现先下降后上升的趋势。侵袭实验显示,热刺激24h到下层的细胞为(31.2±4.4)个,少于对照组的(46.2±3.5)个,t=6.66,P<0.001;而48〔(57.2±3.4)个〕和72h〔(57.0±2.2)个〕穿透至下层的细胞数量多于对照组,差异有统计学意义,t值分别为3.14和3.99,P值分别为0.014和0.004。迁移实验显示,热刺激24hA549细胞迁移能力较对照组下降〔(17.0±3.5)vs(32.0±3.3)个〕,t=5.09,P<0.001,48〔(48.5±3.5)个〕和72h〔(55.3±3.2)个〕则迁移能力增强,差异有统计学意义,t值分别为3.16和8.29,P值分别为0.014和<0.001。MMP-2和MMP-9表达也出现先下降再上升的趋势,与对照组相比,MMP-2蛋白热刺激12和24h相对表达量分别为0.54±0.05和0.59±0.05,t值分别为7.13和6.35,P值分别为0.002和0.003;48和72h相对表达量分别为1.65±0.12和2.50±0.21,t值分别为7.21和11.17,P值分别为0.002和<0.001,不同时间差异有统计学意义,F=139.00,P<0.001;MMP-9蛋白12和24h相对表达量分别为0.32±0.07和0.52±0.04,t值分别为9.65和7.72,P值分别为<0.001和0.002;48和72h分别为1.44±0.22和1.85±0.32,t值分别为3.15和4.39,P值分别为0.034和0.012,不同时间差异有统计学意义,F=35.99,P<0.001。转录组测序分析及RT-PCR显示,热刺激12h,与应激状态下肿瘤细胞的存活和增殖有密切关系的STC2(1.24±0.12;t=3.10,P=0.036)和SFN(2.40±0.27;t=8.42,P=0.001)基因表达与空白对照组比较显著上调,而在热刺激24h,与肿瘤恶性生物学行为及上皮间质转化(EMT)密切相关的EGR1(39.12±2.12;t=31.41,P<0.001)、CPA4(3.30±0.30;t=12.60,P=0.002)、STC2(2.74±0.70;t=4.26,P=0.013)和MDM2(1.99±0.60;t=2.81,P=0.048)等基因表达显著上调。GO分析和KEGG分析也发现在热刺激24h,细胞恶性转化和EMT相关信号通路基因富集。结论肺癌细胞受到亚致死热损伤刺激的初始阶段,出现抵抗不良刺激的反应,而后多个恶性生物学相关的基因上调和信号通路激活,导致转移能力增加,这可能是肺癌不全消融复发的潜在机制。