谷氨酰胺缺乏诱导CD8^(+)T细胞铁死亡促进肿瘤生长

目的探究谷氨酰胺(glutamine,Gln)对CD8^(+)T细胞抗肿瘤免疫反应的影响及机制。方法TCGA数据库分析肿瘤Gln代谢与浸润CD8^(+)T细胞数量及功能的关系。利用CRISPR/Cas9敲低MC38细胞GLS表达,构建小鼠肿瘤模型。流式细胞术检测肿瘤增殖和凋亡,分析肿瘤浸润免疫细胞数量和功能。用Gln缺乏的培养基、完全培养基或添加GSH、RSL3的培养基分别处理CD8^(+)T细胞,检测GSH含量,细胞凋亡,GPX4和Lipid-ROS及效应功能蛋白表达,并进行RNA-seq分析。结果肿瘤Gln代谢与肿瘤浸润CD8^(+)T细胞数量和功能负相关。敲低MC38细胞GLS表达抑制了C57BL/6肿瘤的生长及Ki67的表达,促进了Caspase3表达,提高了肿瘤浸润免疫细胞的数量,抑制了肿瘤浸润CD8^(+)T细胞PD-1、TIM-3和LAG-3表达,并提高了CD8^(+)T细胞CD137、CD107a、IFN-γ及TNF-α表达。RNA-seq结果显示,Gln缺乏后CD8^(+)T细胞铁死亡相关基因TFRC、HMOX1、CYBB、SLC7A11表达上调。Gln缺乏后CD8^(+)T细胞死亡增多、CD137、CD107a、IFN-γ、GSH和GPX4表达下调,Lipid-ROS表达上调;补充GSH后CD8^(+)T细胞GPX4上调,Lipid-ROS下调,CD8^(+)T细胞分泌的IFN-γ增多。结论Gln缺乏诱导CD8^(+)T细胞铁死亡抑制其效应功能。

基于LCK募集和活化的嵌合抗原受体T细胞的结构优化及其功能研究

目的 通过对二代嵌合抗原受体(CAR)进行淋巴细胞特异蛋白酪氨酸激酶(LCK)结构改造,探讨能否增强二代CD137 CAR-T细胞的活化水平及杀伤肿瘤细胞效率,为制备新型二代CAR-T细胞奠定基础。方法 利用基因工程技术,构建靶向人表皮生长因子受体-2(HER2)的CD137-LCK2 CAR和CD137-PYAP2 CAR的慢病毒载体,经慢病毒包装、感染活化T细胞后制备出CD137-LCK2和CD137-PYAP2 CAR-T细胞。采用流式细胞术、酶联免疫吸附实验、细胞毒性实验分别检测新构建的CAR-T细胞在活化分子CD137的表达水平、表型分布、分泌的细胞因子水平及对表达HER2的肿瘤细胞的杀伤效率。结果相较于二代CD137 CAR-T细胞,经过结构改造的靶向HER2的CD137-LCK2和CD137-PYAP2 CAR-T细胞能够上调活化分子CD137的表达、增加细胞因子IFN-γ的分泌、增强对靶细胞的杀伤能力,且均有统计学差异;同时能够维持在记忆状态、受抗原刺激后可迅速活化增殖分化。结论 靶向HER2的CD137-LCK2和CD137-PYAP2 CAR-T细胞有望比二代CD137 CAR-T细胞能更有效活化并发挥抗肿瘤效应。

慢性HBV感染不同临床阶段患者外周血T细胞免疫状态的研究

目的:探讨慢性HBV感染(CHI)不同临床阶段患者外周血T细胞状态,为CHI临床分期和防治提供科学依据。方法:本研究收录CHI患者,按照患者临床症状将其划分为免疫耐受(IT)、免疫活跃(IA)、免疫控制(IC)、再活化组(RA),健康志愿者(HD)为对照组。分离外周血单个核细胞(PBMC),使用多色流式细胞术分析患者外周血CD4^+T细胞、CD8^+T细胞亚群频率和CD8^+T细胞表面PD-1的表达量。结果:与HD相比,CHI组T细胞及亚群变化无显著差异;RA组CD3^+T细胞百分比显著下降。对于CD8^+T细胞亚型,IC和RA组初始CD8^+T细胞(Na ve T cell,Tn)频率下降;IT组效应记忆CD8^+T细胞(Tem)频率降低;而IC组效应CD8^+T细胞(Te)频率显著增高(P<0.05)。相较于高HBV DNA载量组(IT),低HBV DNA载量组(IC和RA)Tn频率降低,Te频率增高(P<0.05);IA组CD8^+T细胞PD-1表达量最高,其次是IC组(P<0.05)。对于CD4^+T细胞亚型,与HD相比,CHI中IT和RA组中枢记忆CD4^+T细胞(Tcm)频率明显升高;各组Treg频率均上升,IA组Treg频率升高较明显(P<0.05),Treg频率与ALT呈正相关(r=0.7436,P=0.0036)。结论:临床诊断指标联合CHI患者T细胞亚型频率变化及免疫抑制功能检测,对慢性HBV感染疾病的分期诊断和治疗以及预测预后转归具有重要参考意义。

T细胞免疫治疗实体肿瘤的临床试验疗效分析

过继性T细胞治疗(adoptive cell transfer therapy,ACT)是以肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte,TIL)、基因工程编辑的T细胞受体T细胞(T cell receptor engineered T cells,TCR-T)和嵌合抗原受体T细胞(chimeric antibody receptor engineered T cell,CAR-T)为主的特异性细胞免疫治疗手段。目前TIL和TCR-T疗法,尤其是TIL和TCR-T联合其他方案如白细胞介素(interleukin,IL )-2、程序性死亡受体1(programmed death-1,PD-1)抗体、放疗等在部分晚期实体肿瘤患者的临床试验中取得显著疗效,但相关研究尚处于临床前研究阶段,现就TIL和TCR-T疗法治疗实体肿瘤的临床疗效及常见不良反应的研究进展做一综述。

TLR7/8激动剂R848体外诱导记忆B细胞分化抗原特异性浆细胞的方法研究

目的为了从PBMCs获得病原体特异性浆细胞,我们建立了TLR7/8激动剂R848体外诱导记忆B淋巴细胞分化浆细胞的方法。方法使用TLR7/8激动剂R848联合细胞因子组合,诱导接种乙肝疫苗(3年及以上)的健康志愿者来源的PBMCs,进行体外活化和分化浆细胞。分别利用ELISA和ELISPOT检测培养液上清中总IgG、HBsAg特异性IgG以及总抗体分泌细胞(ASCs)和HBsAg抗原特异性ASCs。结果成功建立R848体外诱导PBMCs中记忆B淋巴细胞分化浆细胞的方法。R848(使用质量浓度在1~2.5μg/ml)仅与IL-2联合使用,最早在第5天即可检测到特异性ASCs。结论通过该方法可以从患者恢复期少量(仅需5~10 ml)的外周血中获得抗原特异性抗体分泌细胞用于分析和分选,为中和抗体的制备提供方法。