西太平洋菲律宾海海山区微生物原位富集及其物种多样性分析

为了研究海山区微生物对外源有机物输入的响应情况,更好认识海山区微生物多样性以及它们在深海碳循环中的作用,本研究以硫粉烷烃混合物(CS)、活性污泥(HX)、几丁质(JDZ)、D型天冬氨酸(D-Asp)、二甲基砜(DMSO2)、聚-β-羟丁酸(PHB)等6种不同有机物为底物,通过深海水体原位定植培养系统,分别在西太平洋菲律宾海的海山山顶(2929 m)和山麓(4707 m)进行了为期10个月的微生物原位富集培养。结合高通量测序技术和分离培养方法,对深海原位富集样品进行了微生物多样性分析以及可培养微生物分离鉴定。16S rRNA基因高通量测序结果表明,6个样品共富集得到属于细菌域的15门27纲61目96科150属200种。不同底物富集样品的细菌物种组成差异较大,表明不同底物选择性富集了特定类群微生物。其中,硫粉烷烃混合物富集样品优势属包括Roseobacter_clade_NAC11-7_lineage属、摩替亚氏菌属(Moritella)等;活性污泥富集样品优势属为假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)、Fusibacter属等;几丁质富集样品优势属为弧菌属(Vibrio);二甲基砜富集样品优势属为假交替单胞菌属、鲁杰氏菌属(Ruegeria)等;D型天冬氨酸富集样品的优势属为假交替单胞菌属;聚-β-羟丁酸富集样品优势属为鲁杰氏菌属、Fusibacter属等。对6个原位富集样品进行平板分离培养,共分离鉴定得到277株可培养细菌,分属于5门8纲19目35科63属92种,其中潜在新种62株和潜在新科5株,表明菲律宾海海山环境蕴含了丰富多样的海洋微生物。它们在深海物质循环中的代谢机制和生态贡献还有待进一步研究。

海洋微塑料污染与塑料降解微生物研究进展

塑料垃圾在近海、大洋水体和沉积物中均广泛存在,并不断累积,对海洋生态系统构成了重大威胁,引起了国际社会的高度关注。本研究从环境生态和塑料降解微生物两个角度回顾了近几年相关方向上的研究进展,包括国内外海洋塑料特别是海洋微塑料在近海与深海等环境中的分布与丰度,以及近海、大洋等环境中降解菌多样性及其降解机制。总体而言,微塑料广泛分布在多种海洋环境,特别是在河口和近海的海水和沉积物,近岸沙滩,以及大洋环流中心;目前已报道的塑料降解菌及其降解酶主要来自陆地土壤和塑料垃圾处理环境,并以聚对苯二甲酸乙二酯(Polyethylene Terephthalate,PET)降解菌和降解酶的研究最为深入。当前,中国科学家已在近海、大洋深海(深渊)以及极地等大洋环境中,开展了微塑料分布特征和丰度调查,并在生态危害方面开展了研究,但在海洋塑料降解微生物方面还鲜有报道。塑料在海洋环境中的最终归宿以及微生物在塑料降解过程中的作用亟待评估,建议在大洋深海科考中整体布局、联合开展这两个方面的相关研究。

Hippo信号通路与海洋无脊椎动物天然免疫

Hippo信号通路是一条在进化上保守的丝氨酸/苏氨酸激酶级联信号通路,主要参与调控器官大小、组织再生、胚胎发育和肿瘤发生。在果蝇中,经典的Hippo信号通路主要由Hippo(Hpo)、Salvador(Sav)、Warts(Wts)、MOB as tumor suppressor (Mats)、Yorkie(Yki)和Scalloped(Sd)组成。其不仅可通过Fat(Ft)和Crumbs(Crb)等上游分子进行调控,而且还能与NF-κB途径、IFN途径、ROS途径、cGAS-STING信号通路以及Wnt信号通路发生交联,共同调控天然免疫过程。海洋无脊椎动物缺乏获得性免疫,主要依靠天然免疫抵御病原体的侵害。Hippo信号通路作为与生长发育和天然免疫密切相关的信号通路,对海洋无脊椎动物的研究中有着重要的意义。目前,对于海洋无脊椎动物Hippo信号通路所知甚少,关于其在天然免疫中的研究更是寥寥无几。开展Hippo信号通路在海洋无脊椎动物天然免疫过程中功能机制的研究,将为深入了解海洋无脊椎动物的天然免疫调控提供一种新思路。本文通过对Hippo信号通路的组成、调控机制以及其在海洋无脊椎动物天然免疫中作用的研究进行综述。将为海洋无脊椎动物天然免疫研究提供有益的参考。

微泡菌QZHA1褐藻胶裂解酶MAAL1的酶学性质研究

为探究Microbulbifer sp.QZHA1褐藻胶裂解(Escherichia coli)酶MAAL1的酶学性质,将褐藻胶裂解酶基因maal1构建至pET-28a表达载体并利用大肠杆菌BL21(DE3)进行异源表达。研究发现:重组酶MAAL1与来源于Microbulbifer sp.ALW1菌株的褐藻胶裂解酶(WP_23625014.1)同源性最高,为93.69%,且与PL7家族蛋白聚为一支;重组酶MAAL1最适温度为35℃,最适pH为7.5,在pH为5.5~10.5范围内保存24 h仍能保持60%以上的酶活力;MAAL1具备良好的耐有机溶剂特性,在测试的9种有机溶剂中,除异丙醇外,其他有机溶剂在添加量达到30%(体积分数)后,酶活力依然保持在59%以上;重组酶MAAL1最适条件下酶活力为4.3 U/mg,米氏常数(K_(m))值为1.08 mg/mL,最大反应速率(V_(max))为4.75 mg/(mL·min),催化常数(Kcat)值为4.52 s^(-1);重组酶MAAL1对聚β-D-甘露糖醛酸(polymannuronic acid,PolyM)具有底物特异性,对聚α-L-古罗糖醛酸(polyguluronic acid,PolyG)无降解能力;薄层层析分析显示,MAAL1降解海藻酸钠的主要终产物是单糖、二糖和三糖,降解PolyM的主要终产物是二糖和三糖,降解MG杂合片段(heteropolymeric MG blocks,PolyMG)的主要终产物为单糖和二糖,故MAAL1是一种内切型聚甘露糖醛酸裂解酶。重组酶MAAL1具有良好的pH和有机溶剂耐受性,对PolyM具有底物特异性且不降解PolyG,该特性褐藻胶裂解酶首次在微泡菌属中被发现,该酶可为制备甘露糖醛酸寡糖(mannuronate oligosaccharides,MAOS)提供新的候选用酶。

弧菌DS32褐藻胶裂解酶基因vralg1的异源表达和酶学性质研究

对从福建省东山湾沉积物样品中筛选到的菌株Vibrio sp. DS32的褐藻胶裂解酶基因vralg1进行克隆和异源表达,并对其酶学性质进行评估。以DS32基因组为模板,克隆褐藻胶裂解酶基因vralg1,构建了pET-vralg1重组表达载体,并在大肠杆菌中实现了异源表达,对重组酶VRALG1的酶学性质、底物特异性和完全降解产物等进行了测定。结果表明:重组酶VRALG1最适温度为35℃,在5~50℃范围内相对酶活力达到80%以上,最适pH为6.5~7.5,在pH为6.0~9.0范围内保温1 h后相对酶活力在90%以上;重组酶VRALG1最大反应速率为5.919 mmol/(L·min),米氏常数为3.712 mmol/L,最适条件下比活力为5.874 U/mg;K^(+)、Cs^(+)、Na^(+)、咪唑和乙醇对酶活性影响较小,5 mmol/L或50 mg/mL浓度下相对酶活力保持90%以上,EDTA对酶的抑制作用明显,1 mmol/L浓度下可使酶完全失活;重组酶VRALG1对海藻酸钠和聚古罗糖醛酸具有较高的降解活性,TLC分析显示产物主要为单糖、二糖和三糖混合物,结合底物特异性分析,推测重组酶VRALG1是具有明显聚古罗糖醛酸偏好性的内切型双功能褐藻胶裂解酶。本研究成功克隆了弧菌DS32中褐藻胶裂解酶基因并实现了其在大肠杆菌中的异源表达,所得重组酶VRALG1具有优良的海藻酸钠降解活性和明显的聚古罗糖醛酸偏好性,可以用于制备低聚合度的褐藻寡糖。

贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)MCCC 1A15695抑菌蛋白分离纯化及应用研究

对虾“玻璃苗”病的暴发,会导致对虾幼苗大批死亡,给水产养殖带来巨大损失。利用本实验室最近鉴定的“玻璃苗”致病菌副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)vp-HL,从海洋来源芽孢杆菌中筛选拮抗菌,获得一株能够高效抑制vp-HL菌株的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)MCCC 1A15695。经分离鉴定与活性测定,其有效抑菌物质为蛋白类,该蛋白抑菌谱较广,对包括多种弧菌病原在内的17种病原微生物有抑制作用。经Q Seharose Fast Flow阴离子柱层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及液相色谱-质谱联用技术(LC-MS)分离纯化鉴定,确定活性蛋白组分中的有效抑菌物质为枯草杆菌素(subtilisin)、未知蛋白(hypothetical protein)及α-淀粉酶(Alpha-amylase)。蛋白类物质具有高生物安全性,本研究为后续益生菌的开发利用提供了理论基础。

四脊滑螯虾造血组织细胞培养条件的优化

稳定的体外细胞培养体系,可以为基因功能和宿主-病原相互作用研究提供平台。本研究通过对四脊滑螯虾(Cherax quadricarinatus)造血组织(hematopoietic tissue, HPT)细胞的体外培养条件进行优化,以期获得状态稳定、活力良好的造血组织细胞培养物。我们从四脊滑螯虾中分离提取造血组织细胞后,通过对培养基种类(L-15、Express Five、DMEM),谷氨酰胺浓度(0、1%、5%、10%),胎牛血清浓度(0、1%、5%、10%),以及体外培养温度(20、27℃)等培养条件进行优化。细胞形态观察和细胞活力分析结果表明,HPT细胞在添加1%青霉素-链霉素、10%L-谷氨酰胺、1%胎牛血清的L-15培养基中状态最佳,在20℃培养温度下能存活30 d左右。这些培养条件将有利于四脊滑螯虾造血组织细胞的体外培养。

红螯螯虾鳃细胞与血细胞分子标记的鉴定

甲壳动物的鳃中富集了大量血细胞,在循环血细胞稳态调节和免疫防御中发挥重要作用,因此获得区分鳃细胞和血细胞的分子标记将有助于研究鳃血细胞的功能。本研究采用SDS-PAGE电泳法比较了红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)鳃细胞和血细胞的蛋白表达谱,获得3条组织特异性蛋白条带,并通过质谱技术鉴定了8个候选蛋白。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析表明,空泡型-H+-ATP合酶C亚基(vacuolar-H^(+)-ATPase subunit C,V-H^(+)-ATPase)在鳃细胞中的转录水平是在血细胞中的53.3倍;而α-2-巨球蛋白(alpha-2-macroglobulin,α2M)和卵黄膜外层蛋白(vitelline membrane outer layer protein I-like protein,VMO-Ia)在血细胞中的转录水平分别是在鳃细胞中的10.3倍和10.9倍。Western-blot和免疫荧光分析表明,V-H^(+)-ATPase和VMO-Ia蛋白分别在鳃细胞和血细胞中特异性表达。综上,V-H^(+)-ATPase和VMO-Ia可以用作区分螯虾鳃细胞和血细胞的分子标记,可为其他十足目甲壳动物鳃血细胞的研究提供参考。

西太平洋深海水体惰性溶解有机碳降解菌群的细菌多样性

深海水体微生物在有机物矿化中发挥着重要作用。惰性溶解有机碳(RDOC)在深海中最终归宿与微生物影响还有待研究。本研究利用富含RDOC的腐植酸和垃圾渗滤液为生长底物,对西太平洋6个站位不同深度(200~4700 m)水体样品的微生物进行了为期一年的实验室低温富集培养,结合高通量测序技术,对富集物中细菌多样性进行了分析。16S rRNA基因高通量测序结果表明,不同富集组的细菌组成相似,主要包括γ-变形菌纲的食烷菌属(Alcanivorax)、噬甲基菌属(Methylophaga)和Polycyclovorans属,α-变形菌纲的海旋菌属(Thalassospira)、副球菌属(Paracoccus)和短波单胞菌属(Brevundimonas),以及放线菌纲的类诺卡氏菌属(Nocardioides)等。这些优势微生物可能在原位参与了RDOC的深度矿化。

功能化石墨烯对海洋环境中细菌群落结构及生长的影响

功能化石墨烯因其优异的导电、传热和机械性能,应用前景广阔.为了解功能化石墨烯对海洋环境可能的生态毒性效应,其分别加入近岸海水(终质量浓度50 mg/L)和沉积物(终质量分数50 mg/kg)中,模拟海洋环境对样品培养2周,并采用DNA高通量测序技术分析功能化石墨烯对海洋细菌群落结构的影响.结果表明功能化石墨烯对两种海洋环境来源的细菌物种组成均有明显影响,但效果不同:暴露于功能化石墨烯后,海水中细菌的物种多样性和丰度降低,而沉积物中细菌的物种多样性和丰度升高,这可能是功能化石墨烯在海水和海洋沉积物中分散、吸附和团聚等环境行为存在差异所致.然而,在两种海洋环境来源的处理组中,功能化石墨烯的存在均对光合细菌(蓝细菌门)的生长起促进作用.上述结果可为功能化石墨烯的海洋生态安全性评估提供参考.

我国海洋微生物菌种资源保藏与共享服务现状

海洋微生物多样性丰富。我国近年来在海洋微生物多样性调查、资源获取与开发利用等多方面取得重要进展。为促进资源的可持续高效利用,建立了专业的海洋微生物菌种保藏中心,目前库藏海洋微生物菌种2. 2万株。本文介绍了目前中国海洋微生物菌种保藏管理中心库藏资源概况与共享利用情况,以共享记录为基础,从已共享菌株的多样性、库藏资源共享利用以及共享用户等方面开展了统计分析。统计结果显示,共享菌株中超过80%为细菌,其次依次为丝状真菌、酵母、古菌及噬菌体。在菌株水平,已共享细菌覆盖了库藏细菌的28%;在种的水平,已共享细菌覆盖了库藏细菌的47%,包括变形菌纲3 178株,芽胞杆菌纲951株,放线菌纲817株。目前,库藏资源总共享比例约为30%,覆盖了库藏57%的属和49%的种。共享用户目前达266家,其中国内用户244家,国外用户22家。为大洋课题、国家973课题、863课题、自然基金、行业公益性项目、科技支撑及企业项目等各种科技计划,提供了重要的菌种资源保障。据不完全统计,共支撑发表SCI论文达500余篇。中国海洋微生物菌种保藏管理中心在菌株资源的收集、整理和共享等方面,为我国的科研事业提供了大量的资源支撑,取得了较好的社会效益。

深海噬菌体BVE2内溶素的重组表达及其活性研究

本研究从一株来源于西南印度洋沉积物的噬菌体BVE2基因组中得到了一条全长702 bp,编码噬菌体内溶素的基因Lysin132,编码的蛋白共含有234个氨基酸残基,预计分子量为25.74 kDa;氨基酸序列同源比对结果表明BVE2 Lysin132具有多个酰胺酶活性位点。进化树分析结果表明BVE2 Lysin132是一种N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶。将Lysin132克隆到pEASY-Blunt E2 Expression Vector中,构建了E.coli-pEASY-Lysin132表达菌株。成功用IPTG诱导表达,得到了大量带有6×His标签的重组BVE2 Lysin132。经镍柱纯化后进行SDS-PAGE电泳,得到单一目的蛋白条带。酶学性质分析结果表明,重组BVE2 Lysin132的最适反应温度为30℃,在中高温下热稳定性良好,在10~50℃下孵育90 min,仍能保持70%以上的酶活力;最适pH为7.0,在pH 6.0~8.0时均能保持80%以上的酶活力,表明该酶有较宽的pH作用范围;Na+、Mg^(2+)可以使酶活力显著提高20%以上,Ca^(2+)可以使酶活力提高40%以上。抑菌实验结果表明,重组BVE2 Lysin132对革兰氏阴性菌的抑制效果较好,尤其对溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、坎氏弧菌(V.campbellii)、哈维氏弧菌(V.harveyi)的抑制作用显著,与市售微生物溶菌酶相比,抑制效果最高提升了40%以上。因此,本研究获得了一种拥有较宽pH作用范围且热稳定性良好的内溶素,可为开发应用于水产养殖、食品保鲜、医药等领域的新型抑菌剂研发提供基础。

Wnt信号通路与无脊椎动物天然免疫

Wnt作为一条保守的信号通路,其在不同生物过程中的作用已被广泛研究。相比脊椎动物,天然免疫在缺乏获得性免疫的无脊椎动物中显得尤为重要。近年来,由于Wnt信号通路在脊椎动物免疫中的功能被逐渐挖掘,其在无脊椎动物天然免疫中的作用引发越来越多的关注。对Wnt信号通路及其在无脊椎动物天然免疫中的重要作用进行了综述,旨为无脊椎动物的疾病防治提供新思路。

超深渊钩虾Eurythenes gryllus i型溶菌酶的基因克隆与表达

根据研究证明,在机体先天免疫系统中溶菌酶作为重要的效应分子之一,通过参与机体中多种免疫反应,主要是通过形成一个水解体系,从而破坏和消除侵害体内的病原体,进而促使机体实现免疫防御。本研究以生活在深海超深渊海沟极端环境下的钩虾Eurythenes gryllus为材料,首次从Eurythenes gryllus中克隆获得i型溶菌酶(i-type lysozyme)基因EgLyz。序列分析表明,基因EgLyz与已知序列相似性较低,并含有一个失稳酶结构域。综合分析结果表明EgLyz可能是一个新颖的溶菌酶蛋白。在此基础上,对基因EgLyz进行了大肠杆菌原核重组表达,成功获取了较高纯度的可溶性表达产物,为后续生物活性分析奠定了实验基础。

铁还原过程对栖热腔菌Thermosipho ferrireducens JL129W03^(T)的厌氧发酵代谢影响

本研究以分离自西北印度洋深海热液硫化物的铁还原栖热腔菌(Thermosipho ferrireducens)JL129W03^(T)为研究对象,在以四方纤铁矿(β-FeOOH)为电子受体条件下,测定了不同培养时间的细胞生长量和主要的代谢产物,并结合其基因组信息预测了主要代谢途径。结果表明,厌氧糖酵解是该菌的主要代谢途径,发酵代谢产物包括乙醇、乙酸、乳酸、丁酸和CO_(2)。同时,该菌含有[Fe-Fe]型氢酶,可以利用厌氧发酵过程产生的还原态铁氧还蛋白获得电子产生H_(2)。在培养基中添加四方纤铁矿后,促进了菌株的最大细胞生长量(3.17×10^(7)cells/mL至2.19×10^(8)cells/mL),也促进了菌株对淀粉和纤维素的利用率(分别提高了100%和34%)。同时,培养基中添加四方纤铁矿后,菌株JL129W03的乙醇产量增加了76%,而丁酸的产量却降低了73%,对H_(2)、乙酸、乳酸的产生影响较小。本研究对了解Thermosipho ferrireducens JL129W03^(T)的生理代谢特点和进一步应用开发清洁能源(H_(2)、乙醇等)奠定了基础。

南大西洋中脊热液区异化铁还原微生物及其矿化产物分析

【目的】从深海热液区获取异化铁还原微生物(Dissimilatory iron reducing microorganisms,DIRM),分析其矿化速率和矿化产物,认识其参与的深海生物地球化学循环。【方法】以羟基氧化铁(FeOOH)为电子受体,以乙酸等简单有机物做电子供体,在60°C恒温厌氧条件下,对南大西洋中脊深海热液区硫化物样品中的DIRM进行富集、培养;采用扫描电镜(SEM)和透射电镜(TEM)、选区电子衍射(SAED)以及能谱仪(EDS)等方法对矿化产物进行形貌观察与成分分析。【结果】从2个硫化物样品中,共获得了139个铁还原培养物,它们均能将培养基中FeOOH (Fe3+90 mmol/L)转化为矿化产物。电镜下可见明显的晶体形态,以立方体形晶体为主,边长为5.0–20.0 nm;EDS分析表明,所有矿物晶体的主要元素为铁和氧,推测是由菱铁矿和磁铁矿组成的混合矿物。矿物晶体形成的时间差异较大,从3d到54d不等,多数培养物可在11 d到20 d内形成晶体。微生物多样性表明,培养物中优势菌主要为厚壁菌门(Firmicutes)和广古菌门(Euryarchaeota),包括一氧化碳胞菌(Carboxydocella)与脱硫肠状菌(Desulfotomaculum)近似新物种(16SrRNA基因同源性89%–91%)和广古菌地丸菌(Geoglobus)。【结论】热液区高温厌氧细菌与古菌可以利用简单有机物为电子供体进行铁还原,形成铁氧化物晶体。实验结果对于微生物参与铁元素的生物地球化学循环与矿物形成的潜力具有支持作用。然而它们是否参与了热液区铁元素的生物地球化学循环与矿物形成还需要大量研究工作验证。

鲍肠道弧菌YBCH1(_8)褐藻胶裂解酶基因val1的表达及酶学性质研究

[目的]对来自羊鲍肠道中弧菌(Vibrio sp. YBCH18)的褐藻胶裂解酶基因val1进行异源表达并研究其酶学性质。[方法]采用PCR技术获得褐藻胶裂解酶基因val1,分析基因序列,构建重组质粒pET-VAL1并在大肠杆菌中实现异源表达,经纯化后对其酶学性质进行研究。[结果]重组酶rVAL1最适温度为30℃;最适pH为8.5,在pH 4.5~10.0范围内保温30 min仍能保持50%以上的相对酶活力;对海藻酸钠具有良好的底物特异性;Mn^(2+)和Co^(2+)对rVAL1酶活具有明显促进作用,而Fe^(2+)、Fe^(3+)、SDS和EDTA对rVAL1活性抑制作用明显;rVAL1动力学参数Km值为2.23 mg/mL,Kcat为3.28 s^(-1),Vmax为21.70 mg/(mL·min);薄层层析分析显示,VAL1降解终产物主要是单糖组分,推测其属于外切型褐藻胶裂解酶。[结论]成功对褐藻胶裂解酶基因val1进行外源表达,研究发现VAL1是一个PL7家族中具有适冷性的外切型褐藻胶裂解酶,最适条件下比酶活为6.6 U/mg。