宁波舟山港域内5种病毒监测与遗传进化特征分析

为探索宁波舟山港域内发热伴血小板减少综合征(SFTS)的发病率与病死率明显高于省内其他地区的原因,为今后SFTS的检疫、防控与诊治提供科学依据。对发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)及4种类SFTSV病毒采用荧光RT-PCR及间接免疫荧光法用于疑似病例血清样本中病毒的检测,并对确认阳性的样本进行病毒分离、序列测定与基因进化分析。在蜱、螨、鼠传播媒介中SFTSV及4种类SFTSV病毒的检测结果均为阴性,在180例疑似病例血样中仅检出SFTSV,阳性率为51.11%(92/180)。样本病毒分离阳性率为72.31%(47/65)。所分离SFTSV病毒的序列分析结果显示出A与B两个基因型及5个进化分支,其中A型占25.53%、B型占74.47%。当前流行于宁波舟山港域内的SFTSV病毒仅为SFTSV且以B基因型为主。B型SFTSV病毒在国内罕见,在遗传进化上具有相对独立的进化特征。

东海产麻痹性贝毒链状亚历山大藻共附生菌群多样性研究

有害赤潮(harmful algal bloom,HABs)是全球性的严重海洋生态灾害及重大环境热点问题,其产生的赤潮毒素经食物链传递严重威胁人类健康与生命安全。其中,麻痹性贝类毒素(paralytic shellfish poison,PSP)是已知贝类毒素中分布最广、毒性最强、对人类威胁最严重的贝毒,但PSP来源问题仍悬而未决。藻菌相互作用关系是揭示PSP产生机制的关键,为揭示产PSP典型赤潮甲藻——东海链状亚历山大藻(Alexandrium catenella LZ1706)的共附生菌群多样性信息,通过Illumina MiSeq高通量测序分析了LZ1706的共附生菌群种类及相对丰度,同时对其可培养共附生菌株进行了选择性分离及其16S rRNA基因序列扩增与系统发育分析。结果表明,链状亚历山大藻(LZ1706)共附生菌群包括6门,10纲,19目,25科及34属。其中优势门4个,包括变形菌门(Proteobacteria,53. 9%)、拟杆菌门(Bacteroidetes,27. 5%)、蓝藻门(Cyanobacteria,16. 8%)及螺旋菌门(Spirochaetae,1. 5%);优势属5个,包括Cryomorphaceae科未知属(22. 9%)、Cyanobacteria纲未知属(16. 8%)、红细菌科(Rhodobacteraceae)未知属(7. 9%)、糖螺菌属(Saccharospirillum,14. 7%)及Maricaulis属(5. 6%),其未知属种群比例高达50. 6%。分离获得的12株可培养菌株中LZ-27及LZ-7分别为Ponticoccus属与Pseudooceanicola属潜在的新种。

微小亚历山大藻amtk-4共附生菌群多样性及其产毒新种Z1-D的sxtA1基因进化研究

藻菌关系是揭示赤潮生消与防控、赤潮毒素产生机制的关键,而产毒甲藻共附生菌群多样性及可培养菌株的获得是解析藻菌关系的前提。微小亚历山大藻(Alexandrium minutum)是全球性典型赤潮甲藻,其产生的麻痹性贝类毒素(PSP)危害巨大,但目前对其共附生菌群尚缺乏系统性研究。通过高通量测序首次解析了产毒微小亚历山大藻amtk-4共附生菌群的物种种类及相对丰度信息;分离获得可培养菌株并对筛选获得的产毒细菌新种Z1-D的毒素合成基因sxtA1进行了基因进化分析,结果表明,amtk-4共附生菌群包括85个OTU,其中包括10门、20纲、40目、59科及87属。其6个优势属包括Phycisphaeraceae科未知属(11.8%)、Muricauda属(10.3%)、腐螺旋菌科未鉴定属(9.1%)、Hyphomonadaceae科未鉴定属(8.9%)、Haliea属(5.7%)及红细菌科未鉴定属(5.1%)。amtk-4共附生菌群中未鉴定属比例高达53.4%。藻生长稳定期所分离获得的可培养细菌数量及种类最多。5株细菌中菌株Z1-D及Z1-4经分子鉴定分别为亚硫酸杆菌属(Sulfitobacter)及Mesorhizobium属新种。其中Z1-D发酵代谢产物含微量石房蛤毒素(STX),其基因片段orf-01498与蓝藻sxtA1基因高度同源,与产毒蓝藻间可能存在着基因共同进化。

四重荧光定量PCR法鉴定肠炎、鼠伤寒以及伤寒沙门氏菌

目的建立四重荧光定量PCR体系鉴定肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌以及伤寒沙门氏菌。方法针对沙门氏菌属特异性ompC基因、肠炎沙门氏菌sdf基因、鼠伤寒沙门氏菌STM4495和伤寒沙门氏菌STY2021序列设计引物和TaqMan探针,建立多重荧光定量PCR体系,进行特异性与敏感性研究。结果 28株不同血清型的沙门氏菌均扩增出ompC基因,其他13株非沙门氏菌均未出现ompC的非特异性扩增。sdf、STM4495、STY2021的探针和引物分别特异性扩增出肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌以及伤寒沙门氏菌,而25株其他血清型沙门氏菌以及13株非沙门氏菌均未见扩增曲线。敏感性试验显示,该体系的最低检测限分别为48 pg/mL(ompC)、560 pg/mL(sdf)、530 pg/mL(STM4495)、35 pg/mL(STY2021)。结论该方法特异好、灵敏高、能够快速检测沙门氏菌并鉴定肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌以及伤寒沙门氏菌。

HS-GC-FID法测定豆粕中6种溶剂残留

建立了顶空-气相色谱-氢火焰离子化检测法(HS-GC-FID)测定豆粕中6种烷烃类残留溶剂的新方法。豆粕样品经80℃振荡平衡30min后即可进样分析,采用Rxi-5Sil MS毛细管柱分离,FID测定,外标法定量。结果表明,6种目标分析物在0.2～10.0mg/kg间均呈现良好线性关系,相关系数(R2)大于0.990,方法检测限(LOD)0.075mg/kg,定量限(LOQ)0.2mg/kg,平均加标回收率95.3%～106.3%,相对标准偏差(RSD)小于8.3%。该方法操作简单且灵敏度高,可满足豆粕中残留溶剂的日常检测需要。

10例发热伴血小板减少综合征确诊病例实验室误诊原因分析

目的为提高发热伴血小板减少综合征早期诊断的准确性。方法收集RT-PCR阴性的发热伴血小板减少综合征确诊病例首份血清以及恢复期血清各10份,采用套式RT-PCR检测特异性核酸;ELISA方法检测急性期与恢复期血清中特异性抗体Ig G。结果 10份血清均能扩增到新型布尼亚病毒的S、M、L 3个特异性基因片段。10份恢复期血清中均能检测到高浓度的特异性抗体Ig G,其S/CO值分布在23.88~30.69。结论 RT-PCR在诊断发热伴血小板减少综合征疑似病例的急性期血清中存在着误诊现象,应引起临床与流行病学医生重视。套式RT-PCR方法灵敏、特异性高,可作为此类标本的补充试验以降低发热伴血小板减少综合征的误诊率。

舟山群岛各县区新布尼亚病毒基因同源性分析

目的了解舟山群岛各县区流行的新布尼亚病毒的基因同源性。方法采集舟山群岛不同县区5例发热伴血小板减少综合征（SFTS）重症或死亡患者的急性期血清，用Veto细胞分离培养毒株，采用RT-PCR扩增所获毒株L、M、S特异性基因节段，使用DNAStar和MEGA5．2软件进行同源性分析并构建系统进化树。结果5株发热伴血小板综合征病毒（SFTSV）的L、M、S基因序列可分成3个进化分支。第一分支毒株全基因序列与韩国JP系列毒株及日本SPL004A有较高同源性，核苷酸相似度在97．8％；第二分支与临近内陆地区部分毒株和日本的部分毒株序列（SPL057A）均有高度同源性，核苷酸相似度均在98．8％-99．9％；第三分支毒株与来源于江苏（JS2007-1等）、辽宁（LN3／2010）、河南（wCH-97／2011）、安徽（AH15／2010）、河南淮阳山（2010-FQM）、湖北（HB2014-20）有较高同源性，核苷酸相似度在97．8％-98．5％。结论舟山群岛内流行的SFTSV同源性不一，存在韩国．舟山、中国其他地区．舟山传播路径可能性。

副溶血弧菌海产品分离株tdh基因及其临近区域结构分析

【目的】初步探索副溶血弧菌海产品分离株tdh基因区域的结构特征。【方法】采用长距离PCR和基因步移技术进行tdh基因侧翼序列扩增,测序验证后拼接成疑似毒力基因片段,将所获序列与NCBI数据库进行比较,初步明确tdh基因侧翼序列的结构与功能。【结果】海产品分离株ZS34与参考菌株RIMD2210633的tdh基因区域(VPA1310-VPA1327)结构基本一致,核苷酸同源性达98.3%;而FJ14与WZ64株基因组中的tdh基因均与tdh3的同源性最高,在基因组中的位置也不同于ZS34株和参考菌株。FJ14基因组中的tdh与trh-ure基因簇相连,tdh与trh基因间的距离约为15kb,中间分散着类插入序列;菌株WZ64没有trh基因,但tdh基因上游也有类插入序列。【结论】副溶血弧菌海产品分离株tdh基因区域具有多态性且存在类插入序列,是毒力基因水平转移的佐证。

两种ELISA试剂盒检测新型布尼亚病毒IgG抗体的效果评估

目的了解两种新型布尼亚病毒(SFTSV) IgG抗体ELISA试剂盒的检测效果,为其应用提供参考.方法微量中和试验(MNT)、ELISA-1和ELISA-2试剂盒平行检测25例发热伴血小板综合征患者恢复期血清和385例健康人群血清中的SFTSV IgG抗体,以MNT的检测结果为金标准,计算各项比对指标并进行综合评估.结果 MNT和两种ELISA试剂盒用于恢复期患者血清IgG抗体检测效果较好.然而用于健康人群血清IgG抗体检测有较大差异,MNT、ELISA-1和ELISA-2的检出阳性率分别为11.69%、7.79%与5.97%.与MNT相比,2种ELISA方法的灵敏度为51.11%与48.89%,特异性为97.94%与99.71%,正确指数为0.49与0.49,阳性似然比为24.83与166.22,阴性似然比为0.50与0.51,一致性强度值为0.57与0.62.假阳性样本S/CO平均比值3.02,低于共同阳性样本的17.49,其中<3.8者占7份.结论 ELISA-1和ELISA-2用于恢复期患者血清IgG的检测结果准确可靠,而用于健康人群血清IgG的检测结果与标准方法之间一致性偏低,筛查诊断价值不理想.

毕赤酵母发酵表达金属硫蛋白的制备及活性

以Cu Cl2诱导的巴斯德毕赤酵母发酵液为原料,比较高温沉降和等电点沉淀法对发酵液中杂蛋白去除效果,进而通过超滤膜分离、DEAD-FF琼脂糖凝胶层析及EDTA螯合脱除Cu2+,纯化制备MT,并评价其对自由基的清除活性。结果发现,相比于等电点沉淀法,采用80℃保温10 min,再以8000 r/min离心20 min的高温沉淀法,对发酵液中杂蛋白去除及MT保持效果较佳;发酵液再经50 ku平板膜超滤浓缩、DEAE-FF离子交换层析,有效保留了发酵液中MT并去除杂蛋白;采用EDTA螯合去除MT中结合的Cu2+,其脱除率达61.90%;纯化制备MT对Pb2+、Cr6+、Cd2+和Cu2+表现出一定再吸附能力,并具有较好的OH·,O2-·和DPPH自由基清除活性。研究结果可为酵母源MT的分离提取以及进一步活性开发与应用,提供一定的参考与基础。