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题名从兔外周血直接克隆B细胞κ轻链的可变区
被引量:1
- 1
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作者
周吉航
周世权
王晔恺
曾芳
马利娜
刘晓光
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机构
舟山医院细胞分子学实验室
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出处
《解剖学报》
CAS
CSCD
北大核心
2012年第4期479-483,共5页
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基金
浙江省科技计划面上社会发展资助项目(2009C33128)
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文摘
目的从兔外周血总RNA中直接扩增出B细胞κ轻链的可变区序列。方法首先从IMGT/GENE-DB数据库中获取大耳白兔Ig胚系基因Vκ(IGKV)、Jκ(IGKJ)和Cκ(IGKC)的cDNA序列、设计引物,然后以非免疫兔外周血总RNA为模板进行RT-PCR扩增,回收产物并克隆到T载体,随机挑选单克隆测序,最终将序列提交到IMGT/V-QUEST,分析出每个克隆的Vκ-Jκ组合,并利用BioEdit的本地Blast程序比较出Cκ的基因型。结果共设计出4对引物,其中引物对RK.C1[4-5-9]无产物,引物对RK.C1[1-2-7]、RK.C1[3-6-8]和RK.C2[1-2-3-4]有产物,分别回收、克隆到T载体后各挑取20个克隆,共获得51个克隆的插入子序列。没有任何2个克隆的插入子序列完全相同,每个克隆均包含完整的兔Vκ、Jκ及Cκ的5’端序列,其中Vκ-Jκ-IGKC1组合的克隆33个,Vκ-Jκ-IGKC2组合的克隆18个;68个Vκ胚系基因中有22个出现,其中频率最高的是IGKV1S10*01(12次),其次是IGKV1S36*01、IGKV1S37*01和IGKV1S4*01(各5次),其余均为3次以下;8个Jκ胚系基因中只有1个出现,为IGKJ1-2*01;2个Cκ基因的等位基因分别为IGKC1*01和IGKC2*03。33个Vκ-[IGKJ1-2*01]-[IGKC1*01]克隆中有17种不同的组合方式,其中频率最高的为[IGKV1S10*01]-[IGKJ1-2*01]-[IGKC1*01](7次)。18个Vκ-[IGKJ1-2*01]-[IGKC2*03]克隆中有11种不同的组合方式,频率最高的为[IGKV1S10*01]-[IGKJ1-2*01]-[IGKC2*03](5次)。Vκ-Jκ-Cκ组合方式相同的克隆,序列仍具有明显的差异。结论利用自行设计的兼并引物,成功并特异地从兔外周血总RNA中直接扩增出了κ轻链的可变区,且产物具有良好的多样性,但所有Vκ-Jκ-Cκ组合中只出现了1种Jκ基因。
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关键词
外周血
免疫球蛋白
轻链
可变区
反转录聚合酶链式反应
兔
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Keywords
Peripheral blood
Immunoglobulin
Light chain
Variable region
RT-PCR
Rabbit
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分类号
Q291
[生物学—细胞生物学]
R392.13
[医药卫生—免疫学]
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题名从兔外周血直接克隆IgG重链可变区
被引量:1
- 2
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作者
周世权
廖智
杨林
周吉航
刘晓光
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机构
舟山医院细胞分子学实验室
舟山医院-中国科学院北京基因组研究所免疫基因组学联合实验室
浙江海洋学院海洋科学学院海洋生物资源及分子工程实验室
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出处
《解剖学报》
CAS
CSCD
北大核心
2012年第6期762-766,共5页
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基金
浙江省科技计划面上社会发展资助项目(2009C33128)
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文摘
目的从兔外周血总RNA中直接扩增出IgG重链可变区基因。方法先从IMGT/GENE-DB数据库中获取编码大耳白兔免疫球蛋白(Ig)重链可变区(VH)的3个胚系基因片段VH(IGHV)、D(IGHD)和JH(IGHJ),以及编码γ重链恒定区(CH)基因Cγ(IGHG)的cDNA序列,然后设计嵌套引物,以兔外周血总RNA为模板,进行RT-PCR和Nested-PCR扩增,产物经胶回收后克隆到T载体,随机挑选白色克隆测序,最后将序列用Bioedit软件的Local Blast功能比对出Cγ的基因型,同时提交到IMGT/V-QUEST分析出所属的VH、D和JH胚系基因。结果获得25个克隆的插入子序列,每个克隆均为兔IgG重链可变区的编码基因,且包含了完整的VH、D、JH胚系基因片段,以及Cγ基因第1个外显子(CH1)序列的5’端部分,但没有任何2个克隆的序列完全相同。37个IGHV功能基因出现了2个;11个IGHD功能基因出现了8个;11个IGHJ功能基因出现了4个。VH-D-JH组合方式共出现18种,即使VH-D-JH组合方式相同,序列仍具有明显的差异。结论从兔外周血总RNA中直接扩增出了IgG重链可变区,自行设计的引物显示出了高度的特异性和良好的兼并性。
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关键词
外周血
免疫球蛋白
重链
可变区
反转录-聚合酶链反应
序列分析
兔
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Keywords
Peripheral blood
Immunoglobulin
Heavy chain
Variable region
RT-PCR
Sequence analysis
Rabbit
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分类号
Q291
[生物学—细胞生物学]
R392.13
[医药卫生—免疫学]
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