千金藤素对人结肠癌细胞HCT116裸鼠异体移植肿瘤模型肿瘤增殖的影响及机制初探

[目的]通过实验研究观察千金藤素(Cepharanthine,CEP)对人结肠癌的抗增殖作用。[方法]本研究通过活体荧光示踪技术研究CEP对人结肠癌细胞HCT116裸鼠异体移植肿瘤模型的抗结肠癌作用,运用报告基因技术研究CEP对肿瘤相关的8条信号通路活化程度的影响,采用流式细胞仪测定CEP对细胞周期分布的影响。[结果]CEP体外能抑制多种人源肿瘤细胞的增殖,IC50范围为0.8-11.5μM。CEP能使HCT116细胞的S期和G2/M期百分比明显增加。通过对MAPK/ERK、MAPK/JNK、Wnt、Notch、Cell Cycle/pRb-E2F、NFκB、Myc/Max以及Hypoxia等8条信号通路报告基因活化程度的研究,发现CEP主要通过抑制MAPK/ERK和NFκB信号通路起到抑制肿瘤增殖的作用。动物模型的实验结果显示,CEP能抑制肿瘤增殖,促进肿瘤组织坏死。[结论]CEP通过抑制MAPK/ERK和NFκB信号通路的活化抑制人结肠癌细胞HCT116裸鼠异体移植肿瘤的增殖。

重组腺病毒CD82／KAI1对小鼠子宫基质细胞内α5、β3、MMP-9、E-cadherin和β-catenin蛋白表达的影响

目的研究CD82/KAI1对着床窗口期小鼠子宫基质细胞内整合素α5、β3、MMP-9、E-cadherin和β-catenin蛋白表达的影响。方法采用基因工程技术,构建CD82/KAI1腺病毒;用免疫细胞化学技术观察妊娠小鼠子宫基质细胞感染CD82/KAI1腺病毒后,细胞内α5、β3、MMP-9、E-cadherin和β-catenin的表达变化情况。结果①构建的小鼠重组腺病毒的滴度达到6.5×1012pfu/ml,感染原代培养的小鼠子宫基质细胞48h后,CD82/KAI1蛋白有明显表达。②妊娠4d的小鼠子宫基质细胞中E-cadherin、β-catenin、α5、MMP-9均有表达,没有检测到β3的表达;对照组未妊娠小鼠细胞中均没有检测到E-cadherin、β-catenin、α5、MMP-9和β3的表达。③与导空腺病毒组相比,妊娠4d的小鼠子宫基质细胞感染CD82/KAI1腺病毒后,β-catenin和MMP-9表达显著上升(P<0.05),α5表达显著下降(P<0.05),E-cadherin的表达量没有显著变化(P>0.05),未检测到β3的表达。结论成功构建含小鼠CD82/KAI1全基因的重组腺病毒。胚胎植入前小鼠子宫基质细胞内整合素α5、MMP-9、E-cadherin和β-catenin的表达可能受CD82/KAI1的影响。

过表达CD82对植入期小鼠子宫内膜整合素αV、β3、E-cadherin和β-catenin表达的影响

目的探讨CD82对着床窗口期小鼠子宫内膜上皮细胞内整合素αV、β3、E-cadherin以及β-catenin蛋白表达的影响。方法将构建的CD82腺病毒转染原代培养的小鼠子宫内膜上皮细胞。检测妊娠小鼠子宫内膜上皮细胞转染CD82腺病毒后,细胞内整合素αV、β3、E-cadherin和β-catenin的表达变化情况。结果提取的上皮细胞纯度为(93.2±0.6)%。构建的CD82腺病毒转染效率达到(92.0±4.5)%,转染原代培养的小鼠子宫内膜上皮细胞24 h后,RT-PCR检测发现CD82基因表达明显升高。转染48 h后,Western blot检测CD82蛋白水平明显升高。免疫细胞化学检测妊娠第4天的小鼠子宫内膜上皮细胞转染CD82腺病毒后,整合素αV、β3以及β-catenin的表达较未转染组均有明显上升(P<0.05),但E-cadherin的表达量无明显变化(P>0.05)。结论胚胎植入前,CD82可能影响小鼠子宫内膜上皮细胞内整合素αV、β3和β-catenin的蛋白表达。

人组织型纤溶酶原激活剂原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的初步表达

目的:构建人组织型纤溶酶原激活剂(tissue-type plasminogen activator,tPA)原核表达载体,检测其在大肠杆菌Escherichia coli中的初步表达.方法:以含有人tPA基因的质粒为模板,设计引物扩增出含有RGDS-tPA基因并构建到原核表达载体pET28a中,测序证实为正确的rtPA序列,并将pET28a-tPA转化至菌株E.coli BL21(DE3).用IPTG诱导rtPA在E.coli中表达,并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行验证.结果:琼脂糖凝胶电泳获得目的基因片段tPA的条带约在1 700bp处,鉴定为阳性重组体;聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定获得目的蛋白片段rtPA的条带约53KDa,为非活性的包涵体.结论:人组织型纤溶酶原激活剂原核表达载体构建成功,可在大肠杆菌中有效表达.

wnt5a诱导心肌祖细胞向心肌细胞分化的作用研究

目的探讨wnt5a诱导心肌祖细胞CP15-5a向心肌细胞分化的作用。方法利用HEK293细胞扩增重组腺病毒Ad-wnt5a和Ad-GFP;转染CP15-5a细胞后,设置wnt5a组、GFP组和空白对照组。采用流式细胞技术检测Ad-wnt5a和Ad-GFP的转染效率;1周后,通过实时定量PCR(q RT-PCR)检测经Ad-wnt5a诱导的CP15-5a细胞中心肌组织特异性转录因子GATA结合蛋白4(GATA4)、心肌增强因子2C(MEF2C)的表达;2周后,通过Western blotting及免疫荧光技术检测经Ad-wnt5a诱导的CP15-5a细胞中心肌连接因子43(CX43)、心肌肌钙蛋白T(cTnT)的表达;全细胞膜片钳技术检测钠电流(I_(Na))表达。结果 Ad-wnt5a和Ad-GFP转染效率分别为42.8%、44.3%。腺病毒转染CP15-5a细胞1周后,wnt5a组GATA4和MEF2C基因的表达量(分别为1.717±0.220、1.847±0.190)较GFP组和空白对照组(GATA4:1.003±0.087、0.961±0.063,P<0.05;MEF2C:0.456±0.042、0.500±0.095,P<0.05)明显升高,而GFP组与空白对照组比较差异无统计学意义;腺病毒转染2周后,wnt5a组CX43和c Tn T蛋白的表达量(分别为1.597±0.267、0.727±0.100)较GFP组和空白对照组(CX43:0.723±0.047、0.783±0.1333,P<0.05;cTnT:0.217±0.021和0.253±0.102,P<0.01)明显升高,而GFP组与空白对照组比较差异无统计学意义。与GFP组及空白对照组比较,wnt5a组可检测出I_(Na)。结论 wnt5a可诱导心肌祖细胞CP15-5a向心肌细胞分化。