Sprague-Dawley大鼠胃肠道微生物区系的研究

为了揭示Sprague-Dawley大鼠胃肠道微生物群落组成情况,探究大鼠胃肠道不同区域的菌群差异,该研究采用16S rRNA基因序列技术,对Sprague-Dawley大鼠的胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠和直肠的肠腔内容物进行基因组测序和微生物组成分析。结果表明:Sprague-Dawley大鼠不同胃肠道区域的细菌群落组成不同;大肠样本的物种丰富度和多样性高于小肠样本;厚壁菌门是各肠道段的优势菌门,乳酸杆菌属是各肠道段的优势菌属;与小肠相比,大鼠大肠微生物菌群更稳定、多样。研究结果揭示了Sprague-Dawley大鼠的胃肠道微生物群落组成信息,为其作为动物模型的相关研究提供了理论依据。

基于网络药理学、分子对接和实验验证探讨朱茯苓用于失眠的作用机制

为探讨朱茯苓治疗失眠的可能作用机制,通过TCMSP、BAT-MAN、TCMID和STITCH数据库以及文献挖掘筛选朱茯苓的活性成分及潜在靶点,利用TTD、OMIM、GeneCards和CTD数据库获取失眠类疾病的相关靶点,采用Cytoscape软件和String数据库构建活性成分-靶点网络和靶点蛋白相互作用网络,通过BioGPS数据库进行靶点的器官定位,基于David数据库进行GO功能和KEGG通路的富集分析,利用Autodock_vina软件进行活性成分和核心靶点的分子对接验证,最后通过免疫印迹法(Western blot)验证朱茯苓对γ-氨基丁酸(GABA)的两种受体蛋白α1亚基基因GABRA1和γ2亚基基因GABRG2的影响。最终筛选得到朱茯苓活性成分33种,潜在靶点267个,与失眠的交集靶点36个,多作用于脑、心脏等器官;分子对接结果显示GABRA1、GABRG2两个靶点能够与活性成分自发结合并借助氢键等分子间作用力形成较为稳定的构象;富集分析共获得189个GO条目和24条KEGG通路,主要涉及GABA信号通路、5-羟色胺(5-HT)信号通路等;Western blot实验证明朱茯苓能够增强小鼠脑内GABRA1和GABRG2蛋白的表达。通过网络药理学、分子对接和Western blot实验验证,发现朱茯苓可能通过多成分、多靶点、多途径的协同作用发挥镇静安神的作用,为深入进行朱茯苓治疗失眠的作用机制研究提供新思路和新方法。

核PTEN和Survivin蛋白在胃癌组织芯片中的表达及意义

目的:探讨核PTEN和Survivin蛋白在胃癌组织芯片中的表达、临床病理学特征及其意义.方法:在116例胃癌35例正常胃黏膜组织芯片上,应用免疫组织化学En Vision法检测核PTEN和Survivin表达水平,分析核PTEN和Survivin在胃癌的表达与患者淋巴结转移状态、Lauren's分型等的关系及其相互关系.结果:核PTEN和Survivin在正常胃黏膜组织中表达率为100%,核PTEN在胃癌组织中的阳性表达率为51.7%(60/116):Survivin的阳性表达率为44.0%(51/116),核PTEN和Survivin与患者淋巴结转移状态相关(P<0.05),同时,核PTEN还和肿瘤分化程度、Lauren's分型密切相关(P<0.05).核PTEN和Survivin二者之间呈正相关(r=0.088,P=0.001).结论:胃癌组织中存在核PTEN和Survivin低表达:同时检测胃癌组织中的核PTEN和Survivin的表达对判断肿瘤的恶性程度和估计预后有一定意义.

Ezrin和HER2在胃癌组织芯片中的表达及意义

目的:探讨Ezrin蛋白在胃癌组织中的表达,与肿瘤浸润、转移的关系及与HER2的相互作用.方法:485例原发性胃癌组织中高、中、低分化胃癌分别为19例、235例和231例;有淋巴结转移者353例;TNM分期Ⅰ、Ⅱ期166例,Ⅲ、Ⅳ期319例.另外取距肿瘤7cm的正常胃黏膜组织40例.制成8个组织芯片蜡块,用免疫组织化学方法检测石蜡包埋的胃及胃癌组织中的Ezrin和人类表皮生长因子受体2(hum an epidermal growth factor receptor 2,HER2)蛋白表达.所有患者均经外科手术治疗,病理诊断明确,术前未经放、化疗.结果:Ezrin和HER2在胃癌组织中高表达,二者均与肿瘤Lauren's分型和肿瘤分化程度相关(χ2=17.625,χ2=20.386,均P=0.000;χ2=9.474,P=0.009,χ2=13.377,P=0.010);Ezrin同时还与组织学(日本分型)、TNM分期、浸润深度和淋巴结转移相关(χ2=37.542,P=0.000;χ2=12.237,P=0.002;χ2=21.194,P=0.002;χ2=9.868,P=0.007).Ezrin和HER2蛋白表达呈正相关(r=0.129,P=0.004).结论:Ezrin可能是预测胃癌组织浸润、转移有用的指标;联合检测Ezrin和HER2可作为判断胃癌预后、筛选高危转移患者的有效指标并有可能用于指导胃癌的个体化治疗.

PCNA、CXCR4在结直肠癌组织芯片中的表达及意义

目的探讨PCNA和CXCR4蛋白在结直肠癌组织芯片中的表达及其意义。方法在结直肠癌组织芯片上,应用免疫组化EnVision法检测PCNA和CXCR4表达水平,分析PCNA和CXCR4在结直肠癌的表达与患者淋巴结转移状态、肿瘤分化程度的关系及其相互关系。结果 PCNA在结直肠癌组织中的表达率为44.5%(57/128);CXCR4的表达率为43.8%(56/128),PCNA和CXCR4与患者淋巴结转移状态、肿瘤分化程度相关(P<0.05)、二者之间呈正相关(P<0.05)。结论同时检测结直肠癌组织中的PCNA和CXCR4蛋白的表达对判断肿瘤的恶性程度和估计预后有一定意义。

EB病毒相关胃癌临床病理特征分析

目的探讨EB病毒相关胃癌的构成比、淋巴结转移癌的感染状况及临床病理特征。方法原位杂交法检测胃癌组织芯片中EB病毒编码的小RNA(EBERs),分析EB病毒相关胃癌病理形态及患者年龄、性别、淋巴结转移状况等临床特征。结果 486例胃癌中检测出18例感染EB病毒(3.7%),EB病毒位于肿瘤细胞核,在正常胃黏膜、肠上皮化生腺体及间质细胞呈阴性。EB病毒相关胃癌中14例(77.8%)伴淋巴结转移,其中所有癌细胞均表达EBERs。与非EB病毒感染胃癌相比,EB病毒相关胃癌分化程度低(P<0.05),临床TNM分期无明显差别(P>0.05)。结论 EB病毒独立存在于胃癌及其淋巴结转移癌细胞的细胞核中,提示EB病毒和肿瘤细胞同时复制。与非EB病毒感染胃癌相比,EB病毒相关胃癌具有独特的临床病理特征。

SDF-1及其受体CXCR4在结直肠癌组织中的表达及与PCNA的关系

目的:研究结直肠癌组织中基质细胞衍生因子(SDF-1)及其受体(CXCR4)的表达与结直肠癌生物学行为以及与核增殖抗原(PCNA)间的关系,以探讨SDF-1/CXCR4的表达以及PCNA在结直肠癌侵袭、转移中的生物学意义.方法:在结直肠癌组织芯片上,应用免疫组织化学Envision法检测SDF-1/CXCR4和PCNA的表达水平,分析SDF-1、CXCR4和PCNA在结直肠癌的表达与患者淋巴结转移状态、肿瘤分化程度的关系及其相互关系.结果:SDF-1的阳性表达率为60.2%(77/128),CXCR4的阳性表达率为43.8%(56/128).结直肠癌组织SDF-1及CXCR4的阳性表达率均高于癌旁正常黏膜组织(P<0.01).PCNA的阳性表达率为44.5%(57/128).SDF-1/CXCR4和PCNA与患者淋巴结转移状态、肿瘤分化程度相关(均P<0.05),SDF-1/CXCR4与PCNA之间呈正相关(r=0.084,P=0.005;r=0.087,P=0.030).结论:同时检测结直肠癌组织中的SDF-1/CXCR4和PCNA的表达对判断肿瘤的恶性程度和估计预后有一定意义.

胃癌组织中FLNA与MMP-9蛋白表达的关系

目的:分析细丝蛋白A(filamin A,FLNA)在胃及胃癌组织中的表达并探讨其与肿瘤浸润、转移的关系及其与基质金属蛋白酶9(matrix metallopeptidase 9,MMP-9)的相互关系.方法:利用组织芯片通过免疫组织化学方法检测210例胃腺癌,50例正常胃黏膜组织中FLNA和MMP-9蛋白的表达,同时分析二者表达水平的变化与病理参数的关系.结果:胃癌组织中FLNA蛋白表达低于正常胃组织而MMP-9的表达水平高于正常胃组织(P<0.05).FLNA的表达与患者性别、年龄、肿瘤组织学分级无关(P>0.05),而与肿瘤淋巴结转移、临床分期和肿瘤浸润深度相关(P<0.05);Spearman等级相关分析显示:FLNA和MMP-9蛋白表达呈负相关(r=-0.138,P=0.044).结论:胃癌组织中FLNA低表达与肿瘤的淋巴结转移、临床分期、浸润深度相关;我们猜测:FLNA的缺失上调了MMP-9蛋白水平而影响了肿瘤的发生和发展.

分枝结构特异性内切酶-1(FEN1)突变体N266D表达纯化及功能分析

人源分枝结构特异性内切酶-1(Flap endonuclease 1,FEN1)作为DNA复制及DNA修复过程中重要的参与者,在维护基因组稳定和完整性方面具有不可替代的作用。尽管FEN1在很多肿瘤细胞中的表达都发生异常,但FEN1基因体细胞突变或遗传突变事件在人体细胞中却很少发生,发表的文献报道较少。前期在白血病患者骨髓细胞中发现了FEN1基因的一种N266D杂合突变体,基于此,成功构建了FEN1-N266D在原核及真核中的表达重组质粒,纯化了原核FEN1-WT、FEN1-N266D蛋白;通过TAMRA标记的DNA底物,检测了FEN、GEN和EXO的3种酶活性,结果发现N266D突变体的FEN、GEN及EXO活性基本不变;RTCA方法检测发现N266D蛋白过表达使细胞增殖能力受到抑制。通过以上对FEN1突变体N266D蛋白的核酸酶活性及对细胞增殖能力影响的分析,为进一步探讨FEN1突变体N266D在肿瘤发生进展中的潜在功能奠定了基础。

糖原分支酶基因体外增强淡色库蚊抗药性的研究

目的构建淡色库蚊糖原分支酶基因(GBE)的昆虫表达载体,通过细胞转染法鉴定其与蚊虫抗药性相关的关系。方法用基因重组方法构建GBE的昆虫表达载体;通过脂质体转染法将昆虫表达载体转入伊蚊C6/36细胞,继而通过观察细胞形态及3H TdR掺入法检测稳定表达GBE基因的细胞对溴氰菊酯杀虫剂的敏感性。结果成功构建GBE基因的昆虫表达载体同时通过筛选获得稳定表达该基因的细胞株。3H TdR掺入法结果显示转染GBE基因能够提高细胞的存活率,并与对照组差异有显著性(P<0.05)。结论 GBE基因在与淡色库蚊溴氰菊酯抗性相关,且其在细胞对抗溴氰菊酯的毒性作用中有保护作用。

胃癌及EB病毒相关胃癌组织中P16和CyclinD1的表达及意义

目的探讨抑癌基因P16和CyclinD1蛋白在胃癌及EB病毒相关胃癌组织中的表达及其临床意义。方法应用组织芯片和免疫组织化学方法检测125例胃癌标本中P16及CyclinD1蛋白的表达;用EBERs原位杂交的方法筛选EB病毒相关胃癌。结果 P16和CyclinD1在125例胃癌组织中的表达率分别为50.4%(63/125)和80.8%(101/125);P16和CyclinD1的表达均与淋巴结转移相关(P<0.05);在胃癌组织中的表达呈明显的负相关(R=-0.321,P=0.000)。EB病毒相关胃癌的发病率为6.4%(8/125);EB病毒相关胃癌中P16不表达而Cy-clinD1表达率为100%,二者呈负相关(R=-0.300,P=0.001)。结论 P16与CyclinD1的相互作用可能参与了胃癌包括EB病毒相关胃癌的发生。

CIITA基因表达水平与胶质瘤放疗敏感性关联研究

为探讨CIITA(MHCII类反式激活蛋白)基因表达水平与脑胶质瘤放疗敏感性关系,采用Cox比例风险回归模型,对TCGA、CGGA693、CGGA3253个独立公共数据集数据进行整理分析,研究CIITA高、低表达水平与脑胶质瘤放疗敏感性关系。结果表明:在不放疗情况下,CIITA高、低表达水平与生存率无显著相关,校正HR(CIITA高表达/CIITA低表达)值分别为1.208(0.403~3.621)、1.501(0.743~3.035)和1.281(0.451~3.637),P值分别为0.736、0.250和0.641;而在放疗情况下,CIITA高、低表达水平与生存率显著相关,校正HR(CIITA高表达/CIITA低表达)值分别为1.821(1.086~3.053)、2.052(1.409~2.988)和2.664(1.531~4.634),P值分别为0.023、<0.0001和0.001,结合Kaplan-Meier曲线及log-rank统计检验,结果发现相对于CIITA高表达患者,低表达患者在接受放射治疗后,生存状态更好。这一研究提示,CIITA基因可能与脑胶质瘤患者放射敏感性存在一定的关联。

FANCJ基因在成人急性髓系白血病中的突变图谱

目的:检测分析急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)患者FANCJ基因突变情况,为研究FANCJ突变类型的AML疾病致病机理奠定基础,同时为其疾病防治提供指导。方法:在FANCJ基因蛋白编码区设计引物,采用PCR扩增及sanger测序法检测222例初诊AML患者骨髓细胞中FANCJ基因编码区突变情况,同时检测AML患者黏膜上皮组织FANCJ基因突变情况;采用NCBI Blast在线生物信息学软件分析FANCJ基因突变在不同物种中的进化保守性。结果:测序分析显示,FANCJ基因在蛋白编码区的11个位点出现突变,分别为exon5:c.G430A:p.A144T,exon6:c.A587G:p.N196S,exon9:c.C1255T:p.R419W,exon10:c.G1442A:p.G481D,exon11:c.C1609G:p.L537V,exon16:c.C2360T:p.P787L,exon17:c.C2440T:p.R814C,exon19:c.C2608T:p.H870Y,exon19:c.A2686G:p.I896V,exon19:c.C2830G:p.Q944E,exon20:c.G3412A:p.D1138N,其中A144T、N196S、R814C、I896V及Q944E突变存在复现性;另外,A144、R419、G381、L537、P787、H870、Q944及D1138位点在不同物种中高度保守。结论:在222例AML患者中发现26名患者中存在FANCJ突变,并且突变位点在不同物种中相对保守,功能重要,这为接下来研究FANCJ突变类型的AML疾病致病机理奠定基础,同时为疾病防治提供指导。

EB病毒感染与血管生成在胃癌组织芯片中的关系

目的:探讨EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)感染相关胃癌的构成比,其淋巴结转移癌的感染状况、临床病理特征及与血管生成的关系.方法:用原位杂交法检测胃癌组织中EBV编码的小RNA(EBERs),分析EB病毒相关胃癌的病理形态、患者年龄、性别、淋巴结转移状况等临床特征;用免疫组织化学EnVision法检测血管生成(即血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)蛋白的表达水平,分析EBV和血管生成在胃癌的表达与患者淋巴结转移状态、Lauren's分型等的关系及其相互关系.结果:486例胃癌患者中检测出感染EB病毒者(n=18,3.7%).该病毒位于肿瘤细胞核内;14例EB病毒相关胃癌患者中(77.8%)伴淋巴结转移癌,其中所有癌细胞均表达EBERs;与非EB病毒感染胃癌相比,EB病毒相关胃癌分化程度低(P<0.05),而临床TNM分期无明显差别(P>0.05);血管生成在胃癌组织中的表达率(28.2%,137/486);血管生成与患者淋巴结转移状态,TNM分期相关(P<0.05);同时,血管生成与EBV感染胃癌二者之间呈正相关(r=0.088,P=0.001).结论:EB病毒独立存在于胃癌及其淋巴结转移癌细胞核中;EB病毒相关胃癌具有独特的临床病理特征;胃癌组织中的血管生成对判断EBV感染胃癌的恶性程度和估计预后有一定意义.

FLT3及FLT3-ITD突变体在HEK293T细胞的表达和纯化

目的构建fms相关酪氨酸激酶3(FLT3)及FLT3-内部串联重复序列(FLT3-ITD)突变体的真核表达载体,在HEK293T细胞中稳定表达并通过免疫沉淀技术对蛋白进行纯化。方法从正常人及FLT3-ITD阳性急性髓系白血病患者骨髓干细胞中提取RNA,反转录为cDNA,使用带有流感病毒血凝素(HA)标签序列的特异性引物,采用PCR扩增出人FLT3及FLT3-ITD突变体编码区全长并克隆到CD530A-T2A-GFP载体上。重组的FLT3及突变体FLT3-ITD表达质粒,通过脂质体polyJ et转染到HEK293T细胞进行表达。使用HA抗体结合微珠沉淀带HA标签的FLT3及FLT3-ITD突变体蛋白。然后,通过HA肽段将蛋白竞争洗脱下来,洗脱下来的蛋白经银染染色。结果 FLT3及FLT3-ITD突变体全长编码序列成功构建到CD530A-T2A-GFP载体上,Western blot法及聚丙烯酰胺凝胶银染法成功检测到FLT3及FLT3-ITD突变体蛋白的表达、纯化。结论在HEK293T细胞中成功表达并纯化FLT3及FLT3-ITD突变体蛋白。

FLT3-ITD插入长度对32D细胞增殖、凋亡及靶向抑制剂敏感性的影响

目的:研究FLT3-ITD突变体ITD插入长度对细胞增殖能力、凋亡及靶向抑制剂敏感性的影响,为临床分级治疗FLT3-ITD突变型急性髓系白血病提供数据参考。方法:从先前解析出的ITD序列中挑选3个位置相同或相邻的不同大小的ITD序列,构建FLT3-ITD真核表达质粒;利用慢病毒包被系统建立FLT3-ITD稳定表达32D细胞株;检测FLT3-ITD细胞株细胞增殖情况,经靶向抑制剂AC220处理后的其增殖抑制及凋亡情况。结果:成功构建了ITD1、ITD2和ITD3三株FLT3-ITD稳定表达32D细胞株;ITD1、ITD2和ITD3细胞株在无IL3因子培养基生长条件下48 h后的增殖倍数分别是2.3、3.7和4.3倍;在FLT3小分子抑制剂AC220加药条件下,ITD1、ITD2和ITD3细胞株增殖抑制IC50值分别是0.183、0.446和0.836 nmol/L,凋亡率分别是88.6%、34.2%和16.1%。结论:插入ITD长度长的FLT3-ITD突变体表达细胞在增殖能力和耐受靶向抑制剂AC220的能力方面均增强。

泛素-蛋白酶体系统在家族性心肌病发生发展中的作用进展

泛素-蛋白酶体系统(UPS)可介导错误折叠和受损蛋白质的选择性降解,在许多信号通路中发挥着重要作用。肥厚型心肌病和扩张型心肌病是两种最常见的家族遗传性心肌病,主要为常染色体显性遗传,由编码心肌细胞成分的基因突变引起。本综述对遗传性心肌病中UPS损伤机制及治疗方案的研究进展进行了文献复习。

抗HPV酸酐化乳铁蛋白凝胶的免疫毒理学研究

背景 研究表明抗HPV酸酐化乳铁蛋白凝胶具有良好的降低HPV病毒载量效果,但目前关于其免疫毒性未进行深入研究。评价动物源性医疗器械在小鼠体内的免疫毒性。方法 将45只BALB/c小鼠随机分为3组(实验组、阴性对照组和阳性对照组),每组15只,实验组使用抗HPV酸酐化乳铁蛋白凝胶处理。使用后第30,60,90天时,分析小鼠血液学指标,对小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肾上腺、胸腺、睾丸、附睾等免疫器官称重,检测样本血清中IgE、IgG、IgM浓度和补体C3浓度以及炎症因子(TNF-a、IL-6)水平浓度,通过淋巴细胞转化试验检测机体的特异性细胞免疫反应,并通过流式分析脾脏淋巴细胞中T细胞和B细胞比例。结果 ①实验过程中,小鼠无中毒反应,状态良好;②血红蛋白、红细胞数、白细胞数和血小板与对照组相比均未发生显著变化(P>0.05);③使用后第30,60天时,实验组心脏质量高于对照组(P < 0.05);使用后第30,60,90天,其余脏器质量及脏器质量系数与对照组比较差异均无显著性意义(P > 0.05);④与阴性对照组相比,试验组未引起明显的细胞介导的免疫反应,对小鼠细胞免疫没有显著影响(P>0.05)。而阳性对照组细胞免疫反应明显增加(P<0.01);⑤实验组使用后第30,60,90天的与阴性对照组相比,免疫球蛋白(IgE、IgG、IgM)液度和补体C3浓度以及炎症因子(TNF-a、IL6)水平均无显著性差异(P>0.05),而阳性对照组与阴性对照组相比,各因子水平均显著升高(P<0.01);使用后第30,60,90天,实验组B、 T淋巴细胞比例与对照组相比,无显著差异 (P > 0.05)。结论 抗HPV酸酐化乳铁蛋白凝胶具有良好的生物相容性,是一种安全可靠的动物源性医疗器械。

卵巢癌顺铂耐药转录组学分析和拮抗剂筛选的研究

目的探讨卵巢癌细胞顺铂(DDP)耐药后的转录组差异,并基于此筛选找寻潜在的拮抗剂。方法以A2780细胞为研究对象,构建DDP耐药细胞A2780-DDP;通过转录组学测序分析,找寻DDP耐药的关键因素,并以实时荧光定量PCR(qPCR)和Western blot实验进行验证;通过小分子抑制剂筛选,采用CCK-8细胞活力检测的方法找寻潜在拮抗剂。结果成功构建了A2780-DDP细胞株,发现耐药后细胞增殖无差异,但细胞侵袭和迁移能力增强;通过转录组学测序分析,发现ITGB7、Akt等可能是DDP耐药的关键基因,且qPCR和Western blot验证发现两者在A2780-DDP细胞株中存在高表达。CCK-8结果显示,雷公藤内酯醇(TPL)、奥拉帕尼等在A2780-DDP细胞株中具有较好的抑制效果。结论ITGB7/Akt通路在DDP耐药中发挥重要作用,TPL、奥拉帕尼等潜在的DDP耐药拮抗剂可为卵巢癌治疗提供新思路。

淫羊藿苷干粉吸入剂所选装置的计算模拟和实验验证

目的采用计算流体动力学(CFD)进行药物微粒在淫羊藿苷微粉所用两种装置内部的运动情况模拟,并与体外沉积结果进行对比,验证该结果的准确性。方法采用新一代药用撞击器(NGI)进行体外沉积实验,同时进行CFD模拟实验,深入剖析药物微粒在装置流场的运动状态,对两种装置的颗粒逸出率进行评估。然后将两种实验结果进行对比,验证模拟结果。结果体外沉积实验结果表明长吸嘴刺破型装置优于短吸嘴刺破型装置,模拟结果表明长吸嘴刺破型装置的颗粒逸出率高于短吸嘴刺破型装置。结论采用CFD进行药物微粒在干粉吸入装置中运动情况的模拟,得到的结果较为直观,与体外沉积实验结果相一致,可以很好地预测药物微粒在干粉吸入装置中的运动状况,优选长吸嘴刺破型装置。