转染人CXCR4细胞株的构建及其生物学功能的研究

目的:构建稳定表达人CXCR4基因的L929细胞株,分析CXCR4分子对转基因细胞迁移能力的影响。方法:TRIzol一步法抽提人外周血单个核细胞(PBMC)总RNA,RT-PCR扩增出CXCR4基因,双酶切装入逆转录病毒载体pEGZ-Term,与辅助病毒载体用脂质体法共转染包装细胞293T,用其培养上清感染L929细胞72h后,经Zeocin筛选出稳定表达CXCR4分子的L929细胞株;利用微孔隔离小室检测转人CXCR4基因的L929细胞在SDF-1α作用下的迁移能力。结果:构建含CXCR4基因的重组逆转录病毒载体,经转染包装细胞293T后,筛选获得能稳定高表达人CXCR4蛋白的L929转基因细胞,转入人CXCR4基因的L929细胞在SDF-1α作用下介导迁移。结论:成功构建转染人CXCR4细胞株,为肿瘤迁移模型的研究和鼠抗人CXCR4mAb的制备打下基础。

佛波酯对人视网膜神经母细胞瘤Y79细胞株表达CD133的调节作用

目的研究佛波酯(PMA)对人视网膜神经母细胞瘤表达CD133的影响。方法以人视网膜神经母细胞瘤Y79细胞株为研究对象,采用流式细胞术、RT-PCR方法检测PMA刺激后Y79细胞株CD133的表达。结果5ng/ml PMA显著增加CD133的表达,其作用在PMA刺激48h后最为明显。但与此同时,CD133mRNA表达较刺激前明显下降。H-7抑制PMA对Y79细胞的作用。结论PMA能够诱导人视网膜神经母细胞瘤Y79细胞株CD133蛋白表达增加。这一作用主要通过活化蛋白激酶C(PKC)通路来实现,而CD133抗原表达可能是转录后进行调节。

AC133-2分子的克隆及其逆转录病毒表达载体的构建

目的克隆人AC133-2全长基因,构建PGEZ-Term-AC133—2逆转录病毒表达载体。方法采用分段克隆的方法,通过聚合链式反应从胎肝文库中克隆AC133-2,并构建AC133—2基因的逆转录病毒表达载体。结果成功克隆AC133—2全长基因并构建PGEZ-Term-AC133-2逆转录病毒表达载体。结论AC133-2全长基因克隆及构建逆转录病毒表达载体的成功,为构建AC133-2转基因细胞和制备抗人AC133-2单克隆抗体和研究AC133-2的生物学功能奠定了物质基础。